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摘要人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV)是一种感染人类免疫系统的病毒，可通过破环人的淋巴细胞影响细胞免疫和体液免疫过程，导致免疫系统瘫痪，对人类健康存在极大威胁。最新的研究结果表明，CCR5受体是HIV进入T细胞的共受体，因此破坏基因组中的CCR5基因或阻止CCR5基因表达成了阻断HIV侵染人类T细胞的一种新途径。<br>　　本文运用Ni磁珠与Co磁珠亲和层析技术纯化出超正电荷ZFN融合蛋白，验证出该蛋白具有切割CCR5基因的活性，从而为后续阻断HIV进入T细胞以及HIV基因治疗提供了新思路。本文主要研究结果如下：<br>　　1.超正电荷ZFN融合蛋白的表达<br>　　运用IPTG对转化了pET22b-(+)36GFP/ZFNL和pET22b-(+)36YFP/ZFNR质粒的两种菌株进行诱导，然后分别在不同温度和不同IPTG浓度的条件下过夜培养，次日分别收集菌体进行超声破碎，SDS-PAGE检测蛋白分布情况。实验结果确定16℃，0.5mM IPTG诱导是融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR表达的最适条件。<br>　　2.超正电荷ZFN融合蛋白纯化条件的摸索<br>　　1）通过Ni磁珠亲和层析技术纯化+36GFP/ZFNL融合蛋白，发现高盐裂解液条件有利于此融合蛋白挂柱，后续洗脱可以有效获得该融合蛋白。<br>　　2）+36YFP/ZFNR融合蛋白同样在高盐裂解液条件下有利于其挂柱，但后续洗脱困难，推测该融合蛋白与Ni磁珠结合过于牢固。然后运用了Co磁珠和已使用两次的Ni磁珠对该融合蛋白进行纯化，发现该方法可以有效获得+36YFP/ZFNR融合蛋白。<br>　　3.重组质粒Pet22b/CCR5的构建<br>　　以HCC1954细胞中的基因组DNA作为PCR扩增模板，有效获得人CCR5基因。随后将CCR5目的基因连接到质粒载体Pet22b，经菌落PCR，双酶切及基因测序等方法验证了CCR5基因无突变。<br>　　4.超正电荷ZFN融合蛋白活性检测<br>　　将重组质粒pET22b/CCR5与上述纯化的两个超正电荷ZFN融合蛋白在37℃共孵育1h后，1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现随着超正电荷ZFN融合蛋白摩尔量的增加，重组质粒pET22b/CCR5被切割成线性质粒产物的量也在增加，表明ZFN蛋白活性功能在增强。同时，发现当超正电荷ZFN融合蛋白摩尔量增加到7nM后，该蛋白会对重组质粒pET22b/CCR5产生非特异性切割。<br>　　综上所述，我们在大肠杆菌中成功表达了超正电荷ZFN融合蛋白<br>　　(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR，并利用Ni亲和层析技术对上述两种融合蛋白进行了纯化。在此基础上，本文还构建了重组质粒Pet22b/CCR5，验证了这一对超正电荷ZFN融合蛋白对靶基因的体外切割活性即ZFN融合蛋白对基因组DNA的编辑功能。本文为研究超正电荷ZFN融合蛋白在体内的活性奠定了坚实的理论基础，也为HIV基因治疗方法提供了新思路。