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摘要肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的一种肝脏肿瘤。肝癌具有病情发展快、恶性度高、生存期短等特点。临床上治疗癌症的主要方法有手术切除、放射性治疗和药物化疗,手术切除仍然是治疗肝癌的首选。然而,即使手术切除后，患者在五年内的肝癌复发率和转移率都很高，这给临床上肝癌治疗带来了极大的挑战。而且，肝癌患者在确诊时通常已发展到中晚期，失去了手术治疗的最佳时机。目前，药物化疗是治疗癌症普遍使用的一种策略。常用的化疗药物缺乏选择性，具有很大的毒副作用。因此，传统的化疗对肝癌的治疗效果非常有限。<br>　　纳米材料的兴起为抗癌药物的发展带来新的契机。开发安全、稳定、靶向以及药物可控释放的多功能药物载体对人类肿瘤的诊断和治疗都具有重要意义。纳米材料具有表面积大、生物兼容性好以及易于修饰等优良特点，可实现抗癌药物的高效、靶向投递。因此，发展纳米材料载体用于靶向运输药物给抗癌药物的发展带来新的曙光。<br>　　癌细胞由于分裂生长迅猛、活动旺盛，因此形成了不同于正常组织、细胞的病理和代谢变化：新生肿瘤血管结构不完整，肿瘤血管的渗透滞留效应增强（enhanced permeability and retention，EPR），无氧代谢、生长失控和跨膜pH调节能力提升形成的肿瘤细胞外部弱酸环境和肿瘤细胞表面相关受体的表达上调。这些不同于正常组织的病理特征，正好为靶向纳米递药系统的设计和应用提供了依据。针对肝脏肿瘤细胞表面或细胞内某些受体分子高表达特性，本文设计合成了3种功能化纳米硒SeNPs@Am、HA-SeNPs@Am和HT-SeNPs@Am载药系统，探索它们对肝癌细胞的选择性、抗肿瘤活性及其机制，旨在寻找潜在的抗肝癌靶向药物。全文共分为四个章节。<br>　　第一章：绪论<br>　　简要介绍目前肝癌发展的现状，传统化疗药物的不足和局限以及纳米药物载体用于肿瘤治疗的优势。重点介绍了纳米硒作为抗肿瘤药物载体的优势以及anisomycin在抗肿瘤方面的研究进展。最后介绍本课题的选题依据、意义及其创新点。<br>　　第二章：被动靶向肝癌细胞的功能化纳米硒SeNPs@Am的制备、抗肿瘤活性及其机制<br>　　被动靶向的原理是基于EPR效应将药物负载在纳米尺寸的载体上，经血液循环靶向进入肿瘤组织，从而实现组织水平的肿瘤靶向。同时结合肿瘤细胞外微酸环境，实现药物的有效释放。基于这点，将细菌源性小分子抗生素anisomycin（Am）负载于纳米硒 SeNPs上，制备功能化纳米硒 SeNPs@Am，实现药物anisomycin的被动靶向输送至人肝癌细胞的目的。<br>　　SeNPs@Am的合成路径如下：通过维生素C（vitamin C，Vc）还原亚硒酸钠（Na2SeO3），尝试多种条件下制备不同粒径的纳米硒（selenium nanparticles， SeNPs）载体，选择最佳粒径SeNPs作为纳米硒载体，在其表面负载anisomycin，制备纳米硒化SeNPs@Am。与未修饰的SeNPs相比，anisomycin修饰使得纳米硒粒径更小，分散更均匀。此外，在纳米硒表面连接香豆素-6，使得该纳米药物载体带有绿色荧光，利于研究SeNPs@Am的细胞摄取行为。<br>　　探索不同粒径下的SeNPs@Am在HepG2细胞内的吸收，发现粒径为56 nm的SeNPs@Am在HepG2细胞内的吸收量最大。因此，选取该粒径的SeNPs@Am用于后续生物功能实验的研究；通过透射电镜、元素分析和纳米粒度仪等分析SeNPs@Am的形貌、元素组成及粒径大小；利用红外光谱和核磁共振仪表征SeNPs@Am分子结构信息；藉荧光显微镜和电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）弄清SeNPs@Am在细胞中的定性和定量吸收及其胞内的定位；运用药物释放试验观察 SeNPs@Am在不同pH条件下anisomycin的释放；借助不同内吞抑制剂确定SeNPs@Am在HepG2细胞中的内吞方式；采用MTT法检测SeNPs@Am处理后HepG2细胞的增殖；流式细胞术分析 SeNPs@Am处理后HepG2细胞的周期和凋亡变化；TUNEL-DAPI双染色进一步确证 SeNPs@Am在HepG2细胞凋亡中的作用；细胞划痕和 Transwell试验观察SeNPs@Am对HepG2细胞迁移的影响；Western Blot分析SeNPs@Am处理后 HepG2细胞的周期调控蛋白和凋亡相关蛋白变化与细胞生物学行为的关系;比较SeNPs@Am与anisomycin的作用差异。<br>　　结果表明，成功合成了功能化纳米硒 SeNPs@Am；SeNPs@Am在 HepG2细胞摄取量高于未修饰的SeNPs；SeNPs@Am通过巨胞饮介导的内吞作用进入细胞，阻滞细胞在 G0/G1期，促进HepG2细胞凋亡和抑制细胞迁移，这主要通过激活P53/P73/P21/P27和caspase-9/caspase-8/caspase-3信号，并下调 CDK-2和ICBP90的活性而实现，似乎与P16、Rb和E2F1无关；在等量anisomycin下， SeNPs@Am较anisomycin显现更强的抑制HepG2细胞生长和迁移并诱导HepG2细胞凋亡的活性。结果提示，将 anisomycin负载于SeNPs形成功能化纳米硒SeNPs@Am后，具有一定的被动靶向抗肝癌活性，其作用优于未修饰的anisomycin。<br>　　第三章：主动靶向肝癌细胞的功能化纳米硒HA-SeNPs@Am的制备、抗肿瘤活性及其机制<br>　　通过 EPR效应只能实现有限的组织水平上的肿瘤靶向，除了肿瘤细胞外的微酸环境，肿瘤细胞表面高表达的受体可用作靶点，通过在纳米载体上修饰可以与这些受体产生特异性结合的靶向分子，从而实现主动靶向肿瘤细胞的策略。这需要选择合适的受体和与之相结合的靶向分子。文献表明，透明质酸（hyaluronic acid，HA）的受体CD44分子在肝肿瘤细胞表面高表达，因此，HA可作为肿瘤靶向分子用于设计靶向肝癌的纳米载药系统。<br>　　HA-SeNPs@Am的合成路径如下：将Na2SeO3溶液滴加至Vc与anisomycin混合溶液后，形成功能化纳米硒SeNPs@Am，在其表面连接HA，制备主动靶向肝癌细胞的纳米硒化HA-SeNPs@Am。在纳米硒表面连接香豆素-6和Cy5.5，使得该纳米药物载体分别带有绿色和红色荧光，利于研究 HA-SeNPs@Am的细胞摄取和体内分布。<br>　　同上方法分析 HA-SeNPs@Am的形貌、元素组成及粒径大小，表征HA-SeNPs@Am分子结构信息，弄清 HA-SeNPs@Am在 RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2细胞中的定性和定量吸收及其胞内定位，观察HA-SeNPs@Am在不同pH条件下anisomycin的释放，确定HA-SeNPs@Am在HepG2细胞中的内吞方式，检测HA-SeNPs@Am对RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2细胞增殖的抑制效果，分析HA-SeNPs@Am处理RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2细胞后细胞周期和凋亡的变化，测定HA-SeNPs@Am处理后RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2细胞迁移的变化，探明HA-SeNPs@Am处理后HepG2细胞的周期调控蛋白和凋亡相关蛋白变化与细胞生物学行为的关系；比较HA-SeNPs@Am与SeNPs@Am对HepG2细胞生物学行为的作用差异。<br>　　有文献报道，转录因子 Oct4、Sox2和 Nanog在肝癌干细胞中高表达，且Oct4在肝癌干细胞凋亡中扮演着重要角色。那么，HA-SeNPs@Am是否通过Oct4影响HepG2细胞凋亡及其与Sox2和Nanog之间的关系？因此，利用单独或联合敲低oct4、sox2和nanog基因策略，通过流式细胞术、qPCR和Western Blot分析HA-SeNPs@Am诱导HepG2细胞的凋亡与Oct4、Sox2、Nanog的mRNA和蛋白表达的关系，以及与GSK-3β和β-catenin表达的关联；进一步通过荷瘤裸鼠模型评价HA-SeNPs@Am在RT-112和HepG2不同肿瘤组织中的靶向分布和体内治疗效果。<br>　　结果表明，成功合成了肝癌靶向的功能化纳米硒 HA-SeNPs@Am，它在RT-112、HepG2、HUVEC-12和 Lo-2细胞间的生物活性具有选择性；与SeNPs@Am比较，HA-SeNPs@Am靶向HepG2细胞活性更高，抑制细胞生长的作用更强；体内试验证实HA-SeNPs@Am能靶向聚集于HepG2肝癌组织内发挥抗肿瘤作用。结果提示，HA-SeNPs@Am具有主动靶向抗肝癌活性，其作用优于SeNPs@Am；HA-SeNPs@Am除了通过激活P53/P73/P21/P27和JNK/Bim/caspase-9/caspase-8/caspase-3信号，抑制ICBP90和Bcl-xL的活性而发挥作用外，还通过激活肝癌细胞中GSK-3β，抑制β-catenin，下调Oct4、Sox2和Nanog的水平，抑制肝癌干细胞增殖，从而抑制肝脏肿瘤的生长；此作用可能也与HA-SeNPs@Am阻止CD4+T细胞向Treg、Th17和Th22细胞分化，上调TNF-α和IFN-γ，抑制TGF-β和IL-10分泌有关。<br>　　第四章：主动靶向肝癌细胞的功能化纳米硒 HT-SeNPs@Am的制备、抗肿瘤活性及其机制<br>　　有文献报道，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）受体在肝癌细胞中高表达。基于这点，我们将肝癌靶向分子5-HT连接在负载抗肿瘤药物anisomycin的功能化纳米硒表面，制备一种新型的靶向肝癌的纳米硒化HT-SeNPs@Am。通过5-HT与肝癌细胞高表达的5-HT受体分子的特异性结合来实现anisomycin向肝癌细胞靶向投递的目的。<br>　　HT-SeNPs@Am的合成路径如下：将Na2SeO3溶液滴加至Vc与anisomycin混合溶液后，形成功能化纳米硒SeNPs@Am，在其表面连接5-HT，制备靶向肝癌细胞的纳米硒化HT-SeNPs@Am。在纳米硒表面连接香豆素-6和Cy5.5，使得该纳米药物载体分别带有绿色和红色荧光，利于研究 HT-SeNPs@Am的细胞摄取和体内分布。<br>　　同上方法分析 HT-SeNPs@Am的形貌、元素组成及粒径大小，表征HT-SeNPs@Am分子结构信息，弄清HT-SeNPs@Am在HepG2、Lo-2、HUVEC-12和 A549细胞中的吸收及其胞内定位，观察 HT-SeNPs@Am在不同条件下anisomycin的释放，确定 HT-SeNPs@Am在 HepG2细胞中的内吞方式，检测HT-SeNPs@Am对HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549细胞增殖的抑制效果，分析 HT-SeNPs@Am处理后 HepG2的细胞周期和细胞凋亡的变化，测定HT-SeNPs@Am处理后HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549细胞迁移的变化，探明HT-SeNPs@Am处理后HepG2细胞内Stat1、Stat3、c-jun、Bim、E2F2和HIF-1α蛋白表达变化与细胞生物学行为的关系。单独或联合敲低 stat3、hif-1α和 e2f2基因，进一步确定Stat3、HIF-1α和E2F2之间的关系。评价HT-SeNPs@Am在RT-112和 HepG2不同肿瘤组织中的靶向分布和体内治疗效果，比较HT-SeNPs@Am与HA-SeNPs@Am的作用差异。<br>　　结果表明，成功合成了肝癌靶向的功能化纳米硒 HT-SeNPs@Am，其在HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549细胞中的生物活性具有选择性；与anisomycin比较，HT-SeNPs@Am能靶向 HepG2细胞，抑制细胞生长的作用更强；与HA-SeNPs@Am比较，HT-SeNPs@Am对HepG2细胞的选择性及其生物学行为的影响相似，体内试验证实HT-SeNPs@Am能靶向聚集于HepG2肝癌组织内发挥更明显的抗肿瘤作用。结果提示，HT-SeNPs@Am具有主动靶向抗肝癌活性，其作用稍优于HA-SeNPs@Am；HT-SeNPs@Am可能通过激活c-jun/Bim/Stat1信号，下调 Stat3、HIF-1α和 E2F2的水平，阻止肝癌细胞增殖，从而抑制肿瘤的生长。此作用可能也与HA-SeNPs@Am阻止CD4+T细胞向Treg细胞、Th17细胞和Th22细胞分化，上调TNF-α和IFN-γ，抑制TGF-β和IL-10分泌有关。