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摘要子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。子宫内膜癌可分为两型：I和II型。I型为激素依赖型，即雌激素的过度刺激而无孕激素拮抗，可发生子宫内膜增生症，直至癌变。临床上子宫内膜癌的治疗方式主要以手术切除子宫为主。随着医疗技术的进步，在过去20多年中，子宫内膜癌的诊断方法及治疗手段有了持续的发展，然而，其治疗效果仍然没有得到有效改善。虽然子宫内膜癌的发病机制和致病因素的研究取得了一定的进展，但完全阐述清楚其发病机理和寻找的关键的治疗靶标还任重而道远。因此，聚焦于肿瘤早期治疗靶点的筛查以及致病分子机制的阐释是极其重要的，但目前子宫内膜癌发生和发展的生物学机制仍尚未明确。最近越来越多的证据证明肥胖是子宫内膜癌发生的高危因素，然而其分子机制尚不清楚。有研究证明肥胖相关基因FTO与子宫内膜癌的发生有关系。FTO是一个位于染色体16q12.2，长度大于4000Kb的基因。最近的研究发现FTO基因与肥胖症密切相关，FTO基因能够抑制新陈代谢，导致肥胖。在本研究中，我们发现FTO在子宫内膜癌组织中高表达，并且雌激素能够促进FTO的核内定位，进而促进子宫内膜癌细胞的增殖活性。此外，雌激素的膜受体 GPR30也在子宫内膜癌组织中高表达，并且也参与了该蛋白的细胞核核定位。通过免疫共沉淀实验检测了FTO与GPR30的交互作用。并进一步的应用双荧光素酶报告基因的方法分析了影响FTO转核的关键序列。同时应用多种信号通路的抑制剂预处理细胞阻断这些信号通路后，检测FTO在细胞核的积聚状态。MTT分析被用来检测子宫内膜癌细胞的增殖活性，tanswell小室分析法被用来检测细胞的增殖活性。实验发现雌激素通过GPR30信号通路和 mTOR信号通路调控子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭活性，而该调控是通过FTO的转核产生后续效应的。FTO转核后，通过其下游靶基因SSx8分子调控子宫内膜癌的恶性生物学行为。因此，雌激素介导的GPR30‐mTOR‐FTO‐SSX8信号通路可能会成为子宫内膜癌治疗的潜在治疗靶标。因此，本课题从三个方面进行研究：<br>　　（1）首先调查雌激素通过核受体和膜受体介导FTO从胞浆中转移至细胞核；<br>　　（2）阐明是否雌激素通过mTOR信号通路调控子宫内膜癌FTO分子的转核；<br>　　（3）FTO转核对子宫内膜癌恶性生物学行为影响的分子机制及临床资料分析。<br>　　第一部分雌激素通过核受体和膜受体介导FTO从胞浆中转移至细胞核<br>　　目的：通过western blot、IP、免疫荧光等技术分析雌激素的膜受体和核受体对雌激素刺激所导致的FTO转入细胞核的影响。<br>　　方法：应用siRNA基因敲除技术敲低ERa，雌激素处理后，应用western blot和激光共聚焦的方法检测雌激素核受体对FTO核聚集的影响。应用ERa抑制剂ICI处理后，在阻断ERa通路后，通过转染GPR30质粒，利用western blot检测FTO核聚集的影响。在此基础上，应用免疫共沉淀的方法，检测FTO与GPR30的结合情况。<br>　　结果：通过实验验证，提示敲低ERa后，子宫内膜癌细胞核中FTO在雌激素后其转核能力降低。在阻断ERa信号后，过表达GPR30质粒后，雌激素刺激导致增加的FTO核积聚。但是FTO与GPR30没有相互作用。<br>　　小结：雌激素可以通过其核受体和膜受体调控FTO的细胞核积聚。<br>　　第二部分雌激素通过mTOR信号通路调控子宫内膜癌FTO分子的转核<br>　　目的：通过阻断各种信号通路后，应用western blot、免疫荧光等技术分析雌激素刺激后对FTO转入细胞核的影响。<br>　　方法：应用LY294002阻断PI3K/AKT信号通路，应用U0126阻断MERK信号通路，应用Rapmysin阻断mTOR信号通路后，利用western blot检测FTO核聚集的影响。在此基础上，应用免疫荧光和激光共聚焦的方法，检测FTO在细胞核内的定位和分布。<br>　　结果：通过实验验证，提示PI3K/AKT信号通路和MERK信号通路对雌激素诱导的FTO核定位没有影响，主要是通过mTOR信号通路影响其核积聚。阻断mTOR通路后，其核定位和分布减少。<br>　　小结：雌激素可以通过mTOR信号通路调控雌激素介导的FTO的细胞核积聚。<br>　　第三部分 FTO转核对子宫内膜癌恶性生物学行为影响的分子机制及临床资料分析<br>　　目的：探索雌激素诱导的FTO转核对子宫内膜癌恶性生物学行为的影响的分子机制，探索期可能的靶基因调控的作用。同时分析上述分子的表达对临床预后的关系。<br>　　方法：应用芯片分析的方法筛选FTO可能的靶基因并通过PCR和western blot技术进行验证。同时通过双荧光素酶的方法验证影响FTO转核的关键序列。通过免疫组织化学的方法检测FTO及其靶基因在子宫内膜组织中的表达。<br>　　结果：结果提示FTO全长序列是FTO转核所需要的，同时通过芯片筛选和验证发现SSX8分子受到FTO的调控，并且通过他调控子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭。<br>　　小结：FTO转核后通过其下游SSX8调控细胞的恶性生物学行为，同时，其表达有临床预后有紧密联系。