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摘要胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，近年来其发病率呈上升趋势，然而其发病机制仍未确切阐明。非编码 RNA（non--coding? RNA，ncRNA）是一类不编码蛋白质的RNA分子，研究发现其对肿瘤的生物学行为具有重要的调控作用。根据非编码 RNA的长度，可以将其分为微小非编码 RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码 RNA（long? nocoding? RNA，lncRNA）。本研究中我们以miR--212和H19为切入点，分别探讨 miRNA和 lncRNA在胰腺癌发生、发展中的作用及机制。通过 qRT--PCR、Western? Blot、双荧光素酶报告基因实验、CCK--8实验、平板克隆实验、细胞划痕和Transwell侵袭实验发现 miR--212和 H19在胰腺癌中都发挥促癌基因作用。miR--212与胰腺癌的TNM分期密切相关，并且 miR--212能够通过对其靶基因 Patched--1?（PTCH1）调控发挥其促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用；H19与胰腺癌的转移密切相关，并且 H19能够通过拮抗 let--7对其靶基因高迁移率家族蛋白2?（High? Mobility? Group? AT--hook2，HMGA2）的调控并介导上皮--间质转化（Epithelial--Mesenchymal? transition，EMT）促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。通过上述研究阐明了miR--212和H19在胰腺癌中发挥的重要作用及具体机制，为非编码RNA在胰腺癌中发挥的重要作用增添了新的依据，并为胰腺癌的治疗提供了新的潜在靶点。?<br>　　第一部分：miR--212通过调控Hedgehog信号通路中的patched--1促进胰腺癌的增殖和侵袭<br>　　【目的】：探讨miR--212在胰腺癌中的表达情况，miR--212对胰腺癌细胞的生物学功能的影响及其作用机制?<br>　　【方法】：使用qRT--PCR检测miR--212在胰腺癌组织、配对的癌旁组织以及胰腺癌细胞系中的表达情况；将胰腺癌细胞分组三组，分别转染miR--212? mimic、miR--212? inhibitor和negative? control，CCK--8实验检测miR--212对胰腺癌细胞增殖活性的影响，平板克隆实验检测miR--212对胰腺癌细胞克隆形成能力的影响，细胞划痕实验检测miR--212对胰腺癌细胞迁移能力的影响，Transwell实验检测miR--212对胰腺癌细胞侵袭能力的影响。采用生物信息学方法预测miR--212的靶基因，并使用双荧光素酶报告基因实验、qRT--PCR和Western? Blot?实验验证预测的miR--212靶基因。使用? qRT--PCR和免疫组织化学方法检测验证出的miR--212靶基因在胰腺癌组织中的表达情况，TCGA数据挖掘miR--212靶基因和胰腺癌患者预后的关系，spearman相关性分析查看miR--212的表达量和其靶基因的表达量在胰腺癌中的相关性。最后，共转染miR--212和靶基因，并通过CCK--8实验、细胞划痕实验、Transwell实验验证? miR--212是否通过调控靶基因对胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭产生影响。?<br>　　【结果】：qRT--PCR结果显示相对于癌旁组织，miR--212在胰腺癌组织中呈高表达，并且相对正常胰腺导管上皮细胞，miR--212在胰腺癌细胞系 PANC--1、SW1990和BxPC--3中均高表达。转染miR--212? mimic、miR--212? inhibitor和negative? control后，CCK--8结果显示miR--212能够增强胰腺癌细胞的增殖能力，平板克隆形成实验结果显示miR--212能够增强胰腺癌细胞克隆形成能力，细胞划痕实验结果表明miR--212能够促进胰腺癌细胞发生迁移，Transwell实验结果显示 miR--212能够增强胰腺癌细胞的侵袭能力。生物信息学软件预测发现 Hedgehog信号中的膜蛋白? PTCH1是 miR--212的潜在靶基因。通过双荧光素酶报告基因、qRT--PCR和 Western? Blot实验验证了在胰腺癌细胞在中，PTCH1是miR--212的靶基因。qRT--PCR和免疫组织化学结果也显示 PTCH1在胰腺癌中呈低表达，并且 PTCH1的表达量和 miR--212的表达量呈负相关，TCGA数据也显示 PTCH1与胰腺癌患者预后相关。这些结果提示 miR--212的靶基因 PTCH1在胰腺癌中发挥着抑癌基因的作用。为了探讨 miR--212是否通过对PTCH1的调控发挥其对胰腺癌细胞生物学功能的影响，我们将 PTCH1和 miR--212? mimic共转染胰腺癌细胞，结果发现 PTCH1能够部分逆转由 miR--212介导的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化，说明 miR--212能够通过调控 PTCH1的表达行驶其促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。?<br>　　【结论】： miR--212在胰腺癌组织中高表达，miR--212能够通过靶向调控PTCH1促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。?<br>　　第二部分：长链非编码RNA--H19通过拮抗let--7对其靶基因HMGA2的抑制并介导EMT促进胰腺癌的转移<br>　　【目的】：探讨 H19在胰腺癌中的表达情况，H19对胰腺癌侵袭、转移的影响以及作用机制?<br>　　【方法】：使用qRT--PCR方法检测H19在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达情况，根据胰腺癌是否发生转移将胰腺癌组织标本分为发生转移组和未发生转移组，比较两组中 H19的表达情况。使用实时细胞分析系统比较三株胰腺癌细胞 PANC--1、SW1990和BxPC--3的迁移和侵袭能力，并分析H19在这三株胰腺癌细胞中的表达量与其迁移、侵袭能力的相关性。通过细胞转染将H19--siRNA转染进胰腺癌细胞以得到H19低表达的胰腺癌细胞，利用细胞划痕实验和Transwell实验比较H19--siRNA转染组和 negative? control转染组胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。qRT--PCR、Western? Blot检测H19抑制表达后对let--7及其靶基因HMGA2以及? EMT标志蛋白E--cadherin、N--cadherin、Vimenin的影响。最后通过共转染H19--siRNA和let--7? inhibitor并通过细胞划痕和Transwell实验验证H19是否通过let--7发挥其对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。?<br>　　【结果】：qRT--PCR结果显示不仅相比较癌旁组织，H19在胰腺癌中高表达，而且H19在发生转移的胰腺癌组织中的表达显著高于未发生转移的胰腺癌组织。同时，H19在胰腺癌细胞系 PANC--1、SW1990、CFPAC--1、AsPC--1和 BxPC--3中均高表达，实时细胞分析系统显示在 PANC--1、SW1990和 BxPC--3三株胰腺癌细胞中，迁移、侵袭能力依次递减，而这三株胰腺癌细胞系中 H19的相对表达量也顺次递减，组织和细胞实验都提示 H19与胰腺癌的侵袭和转移相关。通过细胞转染将胰腺癌细胞PANC--1分为H19--siRNA组和siRNA--control组，24小时后细胞划痕和Transwell侵袭实验表明H19抑制表达组细胞迁移、侵袭能力均明显降低。Western? Blot实验结果表明H19--siRNA能够显著抑制let--7靶基因HMGA2的蛋白水平，同时导致? EMT?标志蛋白 E--cadherin升高和 N--cadherin、Vimentin蛋白下调。最后共转染 H19--siRNA和let--7? inhibitor后，细胞划痕和Transwell实验表明let--7能够部分逆转由H19介导的胰腺癌细胞迁移、侵袭能力的改变，说明 H19能够通过拮抗 let--7发挥其对胰腺癌侵袭和转移的影响。?<br>　　【结论】：H19在胰腺癌中高表达；H19与胰腺癌的转移密切相关；H19能够通过拮抗miRNA? let--7对其靶蛋白HMGA2的调控并促进EMT发挥其促进胰腺癌侵袭和转移的作用。?