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摘要肝癌在我国已成为我国恶性肿瘤致死病因的第2位。肝癌早期症状不明显，病情进展快，50.5％的新发肝癌患者出现在中国。目前肝癌的治疗主要包括外科手术切除肿瘤、放疗、化疗、介入治疗、射频消融治疗等，但效果不尽人意，因此预防肝癌的发生及改善预后是目前肝癌研究的热点。随着放疗技术的进展，放疗能够杀死肝癌细胞的同时也会造成周围组织的损伤，我们仍需要在提高放疗敏感性方面做更深层次的研究。TAB182又称TNKS1BP1，是通过酵母杂交实验研究Tankyrase1时被第一次发现，一种参与DNA损伤后修复的蛋白，能够与能够和DNA-Pkcs相互作用，还可以影响DNA-Pkcs磷酸化，进一步参与DNA损伤应激反应，本实验室前期研究TAB182可以增加幅射的敏感性，并且具有调节细胞周期等功能，但在肝癌细胞中还没有深入的研究。阿司匹林是一种历史悠久的解热镇痛药，现广泛应用于心血管疾病中，阿司匹林在预防胃癌、食管癌的发生已经被证实，阿司匹林在抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡等方面也有广泛研究，但阿司匹林对于TAB182沉默的肝癌细胞的影响目前还没有相关研究。我们通过阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2细胞可进一步抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡，为放疗及药物治疗肝癌提供新的基因靶点，改善患者预后。<br>　　目的：本实验以离体的肝癌细胞为研究对象，通过稳定转染筛选单克隆技术建立TAB182沉默的HepG2细胞模型，研究γ-射线和阿司匹林对TAB182沉默的HepG2细胞的影响。<br>　　方法：<br>　　通过CCK-8、细胞平板克隆形成实验，研究γ-射线照射后HepG2细胞增殖率和存活率的变化，并应用流式细胞学检测照射后 HepG2细胞周期的变化。通过CCK-8实验验证阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2细胞后增殖能力的变化，流式细胞学检测阿司匹林对 TAB182沉默的HepG2细胞周期及凋亡的改变。应用Western blot检测照射及阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2细胞后凋亡蛋白的表达。<br>　　结果：<br>　　1.抑制TAB182基因表达可增加肝癌HepG2辐射敏感性<br>　　1.1.成功建立的TAB182沉默的HepG2细胞系：与稳定转染对照质粒的HepG2-NC细胞对比，TAB182蛋白在HepG2-sh-TAB182细胞中表达降低，说明TAB182沉默的细胞系建立成功。<br>　　1.2.沉默TAB182基因能增加辐射对HepG2细胞增殖的抑制作用：分别于0、2、4、6、8Gy的γ-射线照射24h后收集 HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞，采用CCK-8方法检测细胞的增殖能力，2Gyγ-射线照射下，HepG2-sh-TAB182细胞及 HepG2-NC细胞与未照射细胞相比，增殖率没有明显变化（P>0.05）。与未照射HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC细胞相比，在4、6、8Gyγ-射线照射后，HepG2-sh-TAB182细胞较未照HepG2-sh-TAB182细胞增殖率明显降低（P<0.05），而HepG2-NC细胞在8Gyγ-射线照射后才出现增殖率的降低（P<0.05）；在同一剂量下， HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞相比增殖率下降（P<0.05），说明沉默TAB182基因能增加辐射对HepG2细胞增殖的抑制作用。<br>　　1.3.沉默TAB182基因能增加辐射对HepG2细胞生存率的抑制作用：采用细胞克隆形成实验检测0、1、2、4、8Gyγ-射线照射下HepG2细胞生存率的变化。在1Gyγ-射线照射后， HepG2-sh-TAB182细胞与未照射HepG2-sh-TAB182细胞相比生存率明显降低（P<0.01），而HepG2-NC细胞与未照射的HepG2-NC细胞相比生存率没有明显变化（P>0.05），在2、4、8Gyγ-射线照射后，HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞与各自未照射细胞比较生存率均出现明显的降低（P<0.01）。在同一剂量下， HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞相比生存率降低（P<0.05），说明沉默TAB182基因表达能增加辐射对HepG2细胞生存率的抑制作用。<br>　　1.4.沉默 TAB182能延长 HepG2细胞幅射后 G2／M期的周期阻滞：γ-射线照射后HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞均出现G2／M期阻滞，但在照射后24小时，HepG2-sh-TAB182细胞在G2／M期的周期阻滞依然存在，而HepG2-NC细胞的G2／M期的周期阻滞已经解除，说明沉默TAB182能延长HepG2细胞幅射后G2／M期的周期阻滞，抑制细胞分裂，此可能导致细胞凋亡增加。<br>　　2.抑制TAB182基因表达可提高阿司匹林对HepG2细胞的疗效<br>　　2.1.沉默TAB182基因能增加阿司匹林对HepG2细胞增殖抑制作用：分别应用0、0.5、1、2、4、8、16mmol/l阿司匹林作用24小时收集HepG2-sh-TAB182细胞及 HepG2-NC细胞，随着阿司匹林浓度的增加，对两种细胞增殖抑制率也逐渐增高，在相同浓度下， HepG2-sh-TAB182细胞比HepG2-NC细胞增殖抑制率要高（P<0.05），说明沉默TAB182基因能增加阿司匹林对HepG2细胞增殖抑制作用。<br>　　2.2.沉默 TAB182能延长 HepG2细胞幅射后 G2／M期的周期阻滞：将8mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182细胞与HepG2-NC细胞，发现HepG2-sh-TAB182细胞在4h即有明显得G2／M期周期阻滞（P<0.01），而HepG2-NC细胞在4h时未发现G2／M期周期阻滞，在12h及24小时时两者均存在G2／M周期阻滞（敲低组P<0.01,对照组P<0.05），在36h， HepG2-sh-TAB182细胞仍存在周期阻滞，而 HepG2-NC细胞周期阻滞已经解除，说明TAB182基因沉默后可延长阿司匹林作用后HepG2细胞G2／M期的周期阻滞，抑制细胞分裂。<br>　　2.3.沉默TAB182能增加阿司匹林对HepG2细胞凋亡：将0、1、8、16mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞，阿司匹林作用 HepG2-sh-TAB182细胞后即出现凋亡，随着阿司匹林浓度的增加，细胞的凋亡率也随着升高，而HepG2-NC细胞在8、16mmo/l的阿司匹林作用下才有凋亡的增高（P<0.05），相同浓度下的HepG2-sh-TAB182细胞与 HepG2-NC细胞相比较， HepG2-sh-TAB182细胞的凋亡率明显高于HepG2-NC细胞（P<0.05），说明沉默TAB182能增加阿司匹林对HepG2细胞凋亡。<br>　　2.4.沉默TAB182能增加辐射及阿司匹林作用后HepG2细胞凋亡蛋白的表达：将4Gyγ-射线照射、16mmo/L阿司匹林作用HepG2-sh-TAB182细胞及HepG2-NC细胞后发现，cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白均较阿司匹林作用前表达明显增加（P<0.05），辐射后HepG2-sh-TAB182细胞比HepG2-NC细胞cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白的表达也明显增加（P<0.05），说明沉默TAB182可促进辐射后的细胞凋亡。<br>　　结论：<br>　　1.验证成功建立的TAB182沉默的细胞系。<br>　　2.沉默TAB182后，在照射及阿司匹林的处理下，能够抑制细胞的增殖率、生存率及细胞分裂，造成细胞凋亡。<br>　　本实验发现TAB182可能是肝癌治疗的敏感基因，可能为肝癌的治疗提供新的治疗靶点。