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摘要目的：同卵双生子（MZT）由一个受精卵分裂形成，DNA序列高度相似，传统的法医学遗传标记如短串联重复序列（STR）、单核苷酸多态性（SNP）等难以将二者区分，是为MZT涉嫌犯罪案件中生物检材身份认定的一大难题。大量研究表明MZT之间存在表观遗传学差异。前期研究应用甲基化免疫共沉淀测序技术（MeDIP），对5对表型一致的MZT进行全基因组甲基化检测分析，从中筛选一些差异甲基化序列，有些分布在CpG岛（GI），有些序列为非 CpG岛序列（non-CGI）。本研究从中选取若干 CGI序列和non-CGI序列进行大样本研究，以验证这些序列区分MZT的效果和能力，为解决甄别MZT个体难题提供科学依据。<br>　　方法：从本课题组建立的双生子样本库中选取100对MZT样本，应用 Qiagen公司的QIAamp DNA Blood kit提取血液样本的DNA。应用ZYMO公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit对基因组DNA进行重亚硫酸氢盐转化，以转化后的DNA为模板，扩增四个位于CGI的序列（CGIS）及四个位于non-CGI的序列。四个CGI序列分别位于2号染色体的基因间区、人类白细胞抗原B伴随转录物3（BAT3）基因启动子区、氨氯吡嗪脒敏感阳离子通道1（ACCN1）基因启动子区、G蛋白信号调节子16（RGS16）基因启动子区，分别命名为CGIS1、 CGIS2、CGIS3、CGIS4。四个non-CGI序列均位于基因间区（IGS），分别命名为 IGS3、 IGS4、IGS5、IGS6，其染色体定位分别为：chr1:114870877-114871203、chr12:67213759-67214092、chr11:5539842-5540207、chr1:56877427-56877787。对扩增产物进行单链纯化后行焦磷酸测序，获得八条靶序列共40个CpG位点甲基化水平的定量数据。每个样本重复三次实验。应用Excel、Spearman相关检验、t检验、方差分析、秩和检验等方法进行统计学分析。<br>　　结果：<br>　　1.八条靶序列的平均DNA甲基化水平<br>　　1.1四个CGI序列的平均甲基化水平。在所调查的152个血液样本中，CGIS1、CGIS2、CGIS3、CGIS4序列的平均甲基化水平分别为：21.37％、0.41%、5.05%、1.56%。<br>　　1.2四个non-CGI序列的平均甲基化水平。在所调查的200个血液样本中，IGS3、IGS4、IGS5、IGS6序列的平均甲基化水平分别为88.18%、87.07%、77.45%、87.87%。<br>　　2.双生子之间甲基化差异分析。参照焦磷酸测序仪用户手册，焦磷酸测序仪灵敏度为5%，在实验中，如甲基化水平差值在双生子之间大于5%，则认为两者之间存在差异，反之则认为无差异。<br>　　2.1各序列双生子间差异分析。在所检测的76对MZT中，CGIS1序列在MZT之间甲基化水平有差异的有6对，占MZT样本量的7.89%，表明CGIS1序列4个CpG位点区分MZT的鉴别能力为7.89%；在所检测的100对MZT中，IGS3、IGS4、IGS5、IGS6序列在MZT之间甲基化水平有差异的分别有37对、7对、48对、44对，四个non-CGI序列累积能够区分81对MZT，占MZT样本量的81.00%，表明四个non-CGI序列16个CpG位点区分MZT的累积鉴别能力为81.00%。对CGIS1序列和四个non-CGI序列区分MZT的能力进行2检验比较分析，发现和non-CGI序列区分MZT的能力高于CGIS1序列区分MZT的能力。<br>　　2.2双生子之间甲基化差异与年龄的相关性分析。探讨双生子间甲基化的差异与年龄的相关性，结果表明，在MZT之间，IGS6序列的DNA甲基化差异与年龄呈较弱的负相关，相关系数为-0.304，也就是，随着年龄增大，MZT之间的甲基化差异逐渐减小。其余序列甲基化水平在MZT之间的差异与年龄均无明显相关性。<br>　　3.甲基化与年龄、性别、民族、吸烟的相关性<br>　　3.1年龄对四个non-CGI序列甲基化的影响。Spearman秩相关分析结果表明， IGS3、IGS4两条靶序列的甲基化程度均与年龄呈弱相关，相关系数分别为-0.161、-0.384。其余两条序列甲基化程度与年龄无相关性。以10岁为年龄间隔，将样本分为6个年龄组：0-10岁、11-20岁、21-30岁、31-40岁、41-50岁及>50岁。比较各年龄组间甲基化水平的差异，分析得出IGS4序列在年龄组间甲基化水平存在显著差异。其余三条序列在各年龄组间甲基化程度无显著差异。<br>　　3.2性别对四个non-CGI序列甲基化的影响。通过比较不同性别间的甲基化水平，结果表明，在所检测的四个non-CGI序列中，甲基化程度在不同性别之间无显著差异。<br>　　3.3民族对四个non-CGI序列甲基化的影响。样本志愿者来自六个民族：汉族、哈尼族、拉祜族、壮族、回族及彝族，由于后四组样本较少，故本研究只分析汉族和哈尼族样本的甲基化水平差异，发现IGS3、IGS6序列的甲基化水平在汉族与哈尼族之间表现出显著差异。其余序列未表现出显著性差异。<br>　　3.4吸烟对四个non-CGI序列甲基化的影响。IGS4序列的CpG2、CpG4位点及IGS6序列的CpG3位点甲基化程度，吸烟组和不吸烟组表现出显著差异，其余序列的甲基化水平在吸烟组与不吸烟组之间无明显差异。<br>　　结论：<br>　　1.对四个CGI候选序列的样本研究结果表明，该四个CGI序列的甲基化程度非常低，在检测的76对MZT样本中，CGIS1序列区分MZT的效能仅有7.89%，提示CGI区域DNA甲基化可能并不是区分MZT的理想区域。<br>　　2.对四个non-CGI候选序列的大样本研究结果表明，该四个位于non-CGI的基因间区序列甲基化程度较高，且区分MZT的能力也较高，累积区分效能达81%，可作为区分MZT的候选序列，提示位于non-CGI的基因间区序列是甄别MZT较为理想的序列。