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HBV相关肝细胞肝癌组织中HBV cccDNA突变位点的筛选及功能研究

摘要乙型肝炎病毒( hepatitis B virus, HBV)突变与肝细胞肝癌( hepatocellular carcinoma,HCC)的相关性一直是乙肝病毒致癌作用研究的热点。然而,从感染 HBV到 HCC,往往经历“慢乙肝-肝硬化-HCC”这一漫长过程,加之 HBV基因组易于变异和宿主的免疫选择压力,感染者体内的 HBV往往存在与“野生序列”高度相关但不完全相同的变异株的动态种群,即准种。这一现象提示我们,每一个体内 HBV的突变往往随着感染时间和疾病进程而逐渐增加。在既往研究中,通过比较 HBV感染不同时期的患者外周血中病毒的突变情况,发现了与 HCC相关的 HBV突变。但由于肝癌患者血清中的HBV突变来自于肝癌组织和非癌肝组织中的 cccDNA突变,并且癌组织中病毒复制能力相对较弱。因此,血清中病毒 DNA的突变不能有效地反映肝癌组织中HBV cccDNA的突变情况。HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)只存在于感染的肝细胞核中,是 HBV复制的模板,具有一定的组织特异性。同时,为消除不同感染阶段这一时间因素对 HBV变异程度的影响,本实验通过比较 HCC患者配对的肝癌与癌旁组织中 HBV cccDNA突变位点的差异,分析这些病毒突变的临床相关性,寻找与 HCC发生、发展相关的病毒突变位点,开展与 HCC发生、发展相关的病毒突变位点相应的功能研究,探索 HBV基因组突变的可能致癌机制。<br>  本研究采用29例 HCC患者术后的癌与癌旁组织,通过实时荧光定量 PCR检测组织中 HBV cccDNA和 HBV total DNA水平,滚环扩增及 PCR产物直接测序 HBV cccDNA全基因组,与野生序列比对寻找 HBV cccDNA的突变位点,并分析 HBV cccDNA突变位点的临床相关性。以 HBV1.2×质粒为基础,通过定点突变技术,构建HBV1.2×-G588C突变及HBV1.2×-T1719G突变质粒,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒突变位点对细胞内3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影响,用时间分辨荧光法检测病毒突变位点对细胞培养上清中 HBsAg和 HBeAg含量的影响。采用双荧光素酶报告实验检测 T1719G突变后是否对 HBV EnhII的活性有影响,并进一步通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)-PCR技术检测 T1719G突变后对 HNF3β与 EnhII之间结合力的影响。通过分别与野生型 HBx质粒及HBx-T1719G突变型质粒共转染,检测T1719G突变的HBx蛋白对HBV复制能力的影响。研究结果如下:<br>  (1)完成了25个癌组织标本和29个癌旁组织标本中 HBV cccDNA的全基因组测序,其中有19对是配对的癌组织与癌旁组织。在19对HBV cccDNA序列中,18对是C基因型,1对是B基因型。25个癌组织的HBV cccDNA序列中23个是HBV C基因型。将所得到的18对 C基因型的 cccDNA序列与 HBV的野生序列进行比对,获得HBV cccDNA全基因组的突变位点。以突变率大于10%的作为突变热点,共筛选出突变热点233个。完成了29对癌与癌旁组织HBV cccDNA和total DNA的定量检测。<br>  (2)将23个癌组织中的各突变位点与患者的临床资料(术后生存时间,BCLC分级、术前 AFP浓度等)及 HBV DNA定量结果进行了统计分析,结果显示 T1719G、C1329A和 T3098C突变与患者的术后生存时间相关,携带突变型A1329或C3098的肝癌患者术后生存时间长于携带野生型 C1329或T3098的患者,而 G1719突变组肝癌患者的术后生存时间短于 T1719野生型组;G1078T、C1653T、G1727A、C1913A、T1978C和 C3116T突变位点与患者术前高浓度的 AFP相关;T1719G和 C1913A两个突变位点与HBV DNA定量结果有统计学意义,其中,突变型G1719组HBV cccDNA和HBV total DNA含量均低于野生型T1719组,突变型A1913组HBV cccDNA的含量高于野生型 C1913组;我们还发现,突变位点 T1719G与患者的 BCLC分级相关, T1719野生型组倾向于较低的 BCLC分级,G1719突变型组倾向于较高的 BCLC分级结果提示T1719G突变后患者的预后差;并且Cox多因素分析结果显示T1719G突变是HCC患者术后生存时间的独立的危险预后预测因素,而T3098C突变是HCC患者术后生存时间的独立的保护预后因素。<br>  (3)G588C突变(可引起 G145A氨基酸突变)只存在于3例癌组织(7C、569C、831C)中,提示 G588C突变可能与 HCC的发生发展有关。G588C突变型组上清中HBsAg的含量低于野生型组(p〈0.05),G588C突变型组细胞内的 HBsAg的含量高于野生型组(p〈0.05),G588C突变型组HBsAg的总量和HBV1.2×野生型组之间的差异无统计学意义(p〉0.05),而 G588C突变型组上清中 HBsAg与细胞内 HBsAg的比值明显低于HBV1.2×野生型组(p〈0.05),并且,G588C突变型组上清中HBV DNA水平与HBV1.2×野生型组之间的差异无统计学意义(p〉0.05)。结果表明G588C突变不影响HBV的复制能力,也不影响HBsAg的表达,而可能影响了HBsAg从细胞内向细胞外的分泌。<br>  (4)在 Huh7和 HepG2肝癌细胞中,HBV1.2×-T1719G突变型质粒与 HBV1.2×野生型质粒相比,可以明显降低培养上清中 HBsAg和 HBeAg的含量(p〈0.001)、细胞内 HBV total RNA和3.5kb RNA水平(p〈0.001)、细胞培养上清中 HBV DNA水平(p〈0.001),双荧光素酶报告实验发现,在 Huh7、HepG2、SK-Hep1和 HEK293T四种肝癌细胞中,T1719G突变组的 EnhII的活性低于野生型组(p〈0.001),当野生型质粒和T1719G突变型质粒分别与 HNF3β质粒共转染时,T1719G突变组的EnhII的活性也低于野生型组( p〈0.001),提示 T1719G突变既降低了 EnhII活性,又影响了HNF3β对EnhII的转录调控活性。ChIP-PCR实验结果表明T1719G突变影响了HNF3β和 HBV EnhII之间的结合力,突变型 G1719与 HNF3β之间的结合力弱于 T1719与HNF3β之间的结合力。在 Huh7和 HepG2细胞中,当 HBV1.2×和 HBV1.2×-T1719G质粒与 HBx质粒共同转染时,与未共转染组相比上清中 HBsAg和 HBeAg的水平没有明显变化(p〉0.05);但当HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共同转染时,与未共转染组相比,上清中 HBsAg和 HBeAg的水平仍然明显下降( p〈0.001);并且, HBV1.2×-T1719G质粒与 HBx-mut质粒共转染组上清中的HBsAg和HBeAg的水平低于HBV1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组(p〈0.001);而HBV1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共转染组上清中的HBsAg和HBeAg的水平与HBV1.2×质粒与 HBx质粒共转染组相比差异没有统计学意义(p〉0.05);当 HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G质粒与HBx质粒或HBx-mut突变质粒共同转染时,与未共转染组相比上清中HBV DNA的水平都升高(p〈0.001);但HBV1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共转染组上清中HBV DNA的水平低于HBV1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组,差异有统计学意义(p〈0.001);而 HBV1.2×-T1719G质粒与 HBx质粒共转染组上清中HBV DNA的水平与HBV1.2×质粒与HBx质粒共转染组相比,差异没有统计学意义(p〉0.05)。这些结果表明T1719G突变可以降低HBV的复制能力,其中突变的HBV EnhII和突变的HBx蛋白都起到了重要的作用。<br>  结果表明癌与癌旁组织中存在差异趋势的突变位点有可能是 HCC发生的重要病毒学因素,通过与临床信息分析找到了一些具有临床相关性的突变位点,G588C突变可能影响 HBsAg的分泌,T1719G突变与患者的 BCLC分级、患者的术后生存时间有关,是 HCC患者术后生存时间的独立危险预测因素,并且 T1719G与 HBV的复制能力有关,通过细胞水平实验证实了T1719G突变可以降低HBV的复制能力。

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