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摘要乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus， HBV）突变与肝细胞肝癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）的相关性一直是乙肝病毒致癌作用研究的热点。然而，从感染 HBV到 HCC，往往经历“慢乙肝-肝硬化-HCC”这一漫长过程，加之 HBV基因组易于变异和宿主的免疫选择压力，感染者体内的 HBV往往存在与“野生序列”高度相关但不完全相同的变异株的动态种群，即准种。这一现象提示我们，每一个体内 HBV的突变往往随着感染时间和疾病进程而逐渐增加。在既往研究中，通过比较 HBV感染不同时期的患者外周血中病毒的突变情况，发现了与 HCC相关的 HBV突变。但由于肝癌患者血清中的HBV突变来自于肝癌组织和非癌肝组织中的 cccDNA突变，并且癌组织中病毒复制能力相对较弱。因此，血清中病毒 DNA的突变不能有效地反映肝癌组织中HBV cccDNA的突变情况。HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA， cccDNA）只存在于感染的肝细胞核中，是 HBV复制的模板，具有一定的组织特异性。同时，为消除不同感染阶段这一时间因素对 HBV变异程度的影响，本实验通过比较 HCC患者配对的肝癌与癌旁组织中 HBV cccDNA突变位点的差异，分析这些病毒突变的临床相关性，寻找与 HCC发生、发展相关的病毒突变位点，开展与 HCC发生、发展相关的病毒突变位点相应的功能研究，探索 HBV基因组突变的可能致癌机制。<br>　　本研究采用29例 HCC患者术后的癌与癌旁组织，通过实时荧光定量 PCR检测组织中 HBV cccDNA和 HBV total DNA水平，滚环扩增及 PCR产物直接测序 HBV cccDNA全基因组，与野生序列比对寻找 HBV cccDNA的突变位点，并分析 HBV cccDNA突变位点的临床相关性。以 HBV1.2×质粒为基础，通过定点突变技术，构建HBV1.2×-G588C突变及HBV1.2×-T1719G突变质粒，采用实时荧光定量PCR技术检测病毒突变位点对细胞内3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影响，用时间分辨荧光法检测病毒突变位点对细胞培养上清中 HBsAg和 HBeAg含量的影响。采用双荧光素酶报告实验检测 T1719G突变后是否对 HBV EnhII的活性有影响，并进一步通过染色质免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）-PCR技术检测 T1719G突变后对 HNF3β与 EnhII之间结合力的影响。通过分别与野生型 HBx质粒及HBx-T1719G突变型质粒共转染，检测T1719G突变的HBx蛋白对HBV复制能力的影响。研究结果如下：<br>　　（1）完成了25个癌组织标本和29个癌旁组织标本中 HBV cccDNA的全基因组测序，其中有19对是配对的癌组织与癌旁组织。在19对HBV cccDNA序列中，18对是C基因型，1对是B基因型。25个癌组织的HBV cccDNA序列中23个是HBV C基因型。将所得到的18对 C基因型的 cccDNA序列与 HBV的野生序列进行比对，获得HBV cccDNA全基因组的突变位点。以突变率大于10％的作为突变热点，共筛选出突变热点233个。完成了29对癌与癌旁组织HBV cccDNA和total DNA的定量检测。<br>　　（2）将23个癌组织中的各突变位点与患者的临床资料（术后生存时间，BCLC分级、术前 AFP浓度等）及 HBV DNA定量结果进行了统计分析，结果显示 T1719G、C1329A和 T3098C突变与患者的术后生存时间相关，携带突变型A1329或C3098的肝癌患者术后生存时间长于携带野生型 C1329或T3098的患者，而 G1719突变组肝癌患者的术后生存时间短于 T1719野生型组；G1078T、C1653T、G1727A、C1913A、T1978C和 C3116T突变位点与患者术前高浓度的 AFP相关；T1719G和 C1913A两个突变位点与HBV DNA定量结果有统计学意义，其中，突变型G1719组HBV cccDNA和HBV total DNA含量均低于野生型T1719组，突变型A1913组HBV cccDNA的含量高于野生型 C1913组；我们还发现，突变位点 T1719G与患者的 BCLC分级相关， T1719野生型组倾向于较低的 BCLC分级，G1719突变型组倾向于较高的 BCLC分级结果提示T1719G突变后患者的预后差；并且Cox多因素分析结果显示T1719G突变是HCC患者术后生存时间的独立的危险预后预测因素，而T3098C突变是HCC患者术后生存时间的独立的保护预后因素。<br>　　（3）G588C突变（可引起 G145A氨基酸突变）只存在于3例癌组织（7C、569C、831C）中，提示 G588C突变可能与 HCC的发生发展有关。G588C突变型组上清中HBsAg的含量低于野生型组（p〈0.05），G588C突变型组细胞内的 HBsAg的含量高于野生型组（p〈0.05），G588C突变型组HBsAg的总量和HBV1.2×野生型组之间的差异无统计学意义（p〉0.05），而 G588C突变型组上清中 HBsAg与细胞内 HBsAg的比值明显低于HBV1.2×野生型组（p〈0.05），并且，G588C突变型组上清中HBV DNA水平与HBV1.2×野生型组之间的差异无统计学意义（p〉0.05）。结果表明G588C突变不影响HBV的复制能力，也不影响HBsAg的表达，而可能影响了HBsAg从细胞内向细胞外的分泌。<br>　　（4）在 Huh7和 HepG2肝癌细胞中，HBV1.2×-T1719G突变型质粒与 HBV1.2×野生型质粒相比，可以明显降低培养上清中 HBsAg和 HBeAg的含量（p〈0.001）、细胞内 HBV total RNA和3.5kb RNA水平（p〈0.001）、细胞培养上清中 HBV DNA水平（p〈0.001），双荧光素酶报告实验发现，在 Huh7、HepG2、SK-Hep1和 HEK293T四种肝癌细胞中，T1719G突变组的 EnhII的活性低于野生型组（p〈0.001），当野生型质粒和T1719G突变型质粒分别与 HNF3β质粒共转染时，T1719G突变组的EnhII的活性也低于野生型组（ p〈0.001），提示 T1719G突变既降低了 EnhII活性，又影响了HNF3β对EnhII的转录调控活性。ChIP-PCR实验结果表明T1719G突变影响了HNF3β和 HBV EnhII之间的结合力，突变型 G1719与 HNF3β之间的结合力弱于 T1719与HNF3β之间的结合力。在 Huh7和 HepG2细胞中，当 HBV1.2×和 HBV1.2×-T1719G质粒与 HBx质粒共同转染时，与未共转染组相比上清中 HBsAg和 HBeAg的水平没有明显变化（p〉0.05）；但当HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共同转染时，与未共转染组相比，上清中 HBsAg和 HBeAg的水平仍然明显下降（ p〈0.001）；并且， HBV1.2×-T1719G质粒与 HBx-mut质粒共转染组上清中的HBsAg和HBeAg的水平低于HBV1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组（p〈0.001）；而HBV1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共转染组上清中的HBsAg和HBeAg的水平与HBV1.2×质粒与 HBx质粒共转染组相比差异没有统计学意义（p〉0.05）；当 HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G质粒与HBx质粒或HBx-mut突变质粒共同转染时，与未共转染组相比上清中HBV DNA的水平都升高（p〈0.001）；但HBV1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共转染组上清中HBV DNA的水平低于HBV1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组，差异有统计学意义（p〈0.001）；而 HBV1.2×-T1719G质粒与 HBx质粒共转染组上清中HBV DNA的水平与HBV1.2×质粒与HBx质粒共转染组相比，差异没有统计学意义（p〉0.05）。这些结果表明T1719G突变可以降低HBV的复制能力，其中突变的HBV EnhII和突变的HBx蛋白都起到了重要的作用。<br>　　结果表明癌与癌旁组织中存在差异趋势的突变位点有可能是 HCC发生的重要病毒学因素，通过与临床信息分析找到了一些具有临床相关性的突变位点，G588C突变可能影响 HBsAg的分泌，T1719G突变与患者的 BCLC分级、患者的术后生存时间有关，是 HCC患者术后生存时间的独立危险预测因素，并且 T1719G与 HBV的复制能力有关，通过细胞水平实验证实了T1719G突变可以降低HBV的复制能力。