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摘要随着癌症早期诊疗水平的提高以及放化疗技术的进步，年轻女性癌症患者的生存率显著增加。但放化疗可能造成女性生育能力的下降甚至丧失，故在放化疗前保存生育能力的问题变得尤为重要。卵巢组织冷冻保存并移植已经被认为是保存生育能力的有效方法，然而有研究表明移植冻融的卵巢组织有可能将原肿瘤灶重新移入体内，因此体外培养或移植窦前卵泡可能是更安全的选择，然而在卵巢组织冷冻复苏后，分离出窦前卵泡前需确定冷冻对窦前卵泡活性的影响，以及选择有活性的窦前卵泡进行移植或体外培养。始基卵泡是卵巢组织内最丰富的卵泡，其仅有一小部分通过卵泡发育途径被激活，而大部分都闭锁，当始基卵泡池内始基卵泡的个数少于1000个时，绝经将随之而来，因此始基卵泡是女性生育能力保存的关键，因此，若能在体外成功的培养始基卵泡，对女性生育能力的保存有着重大的意义。目前国内外有多项研究致力于比较程序化冷冻法和玻璃化冷冻法冷冻卵巢组织的效果,但所得结果尚无定论。此外，目前国内尚无研究报道体外培养始基卵泡的最佳条件。本研究第一部分探讨两种冷冻方法对卵巢组织内窦前卵泡的活性影响，从而为体外培养以及移植窦前卵泡奠定基础。第二部分在体外用二维培养体系和藻酸钠凝胶三维培养体系培养冻融后单个始基卵泡，探讨始基卵泡在体外培养所需的最适的生长环境。<br>　　目的<br>　　探讨玻璃化冷冻法和程序化冷冻法对牛卵巢组织内窦前卵泡活性的影响，以及体外三维培养冻融的始基卵泡的最适藻酸盐浓度。<br>　　材料与方法<br>　　1、实验材料：取新鲜的牛卵巢组织，将卵巢组织皮质剪成大小约为0.5㎝×0.8㎝×0.3㎝的组织块。<br>　　2、实验方法：①将卵巢皮质片随机分为新鲜对照组、程序化冷冻组、玻璃化冷冻组，每组各10片，后两组分别应用其相应的方法冷冻卵巢组织并复苏，三组均随机挑出3-4片卵巢组织用4％多聚甲醛固定，进行组织形态学分析。将三组余卵巢组织分别剪碎，加入Liberase DH酶消化，消化终止后随机挑取窦前卵泡，并记数，然后进行荧光染色，鉴定卵泡的活性。②玻璃化冷冻卵巢组织，解冻后分离出始基卵泡，将其置于二维培养系统(对照组)和浓度分别为0.5%，1%，2%藻酸钠凝胶中培养8天，每隔一天在显微镜下观察卵泡的生长情况，测量卵泡的直径并半量换液，将收集的培养液保存于-20℃的冰箱，并采用电化学发光免疫分析法(ECLIA)测定卵泡分泌的雌二醇(E2)的水平，并在培养8d后进行荧光染色，鉴定卵泡的活性。<br>　　3、统计学方法：用SPSS21.0软件进行统计学分析,计数资料采用卡方检验其他实验数据以均数±标准差( x±s)表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1、三组用组织学分析和用酶解法分离出的单个卵泡的结果均显示，卵巢组织内不同类型的窦前卵泡的数量分布的差异无统计学意义(P＞0.05)，其中以始基卵泡为主，其次为初级卵泡，次级卵泡所占比例最少，未见窦状卵泡。<br>　　2、荧光染色后，程序化冷冻组和玻璃化冷冻组的窦前卵泡中未受损的卵泡（V1）低于新鲜对照组，轻微受损卵泡和中度受损卵泡（V2＋V3）及死亡卵泡（V4）均高于新鲜对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两冷冻组中的未受损的卵泡（V1）数量相比差异无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　3、荧光染色后，在未受损的卵泡中，三组始基卵泡的差异无统计学意义(P＞0.05)，程序化冷冻组初级卵泡低于新鲜组，差异有统计学意义（P＜0.05），而玻璃化冷冻组的初级卵泡较新鲜组无统计学差异，由于分离出次级卵泡所占比例低，故未行统计学分析，玻璃化冷冻与程序化冷冻组中未受损的初级卵泡相比，其差异无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　4、体外培养始基卵泡8d后，发现卵泡在二维培养环境中难以存活，藻酸钠三维培养系统更适合体外培养始基卵泡。<br>　　5、在浓度为0.5%，1%，2%的藻酸盐凝胶分别培养始基卵泡8天后发现，卵泡的直径均有不同程度的增加，其中在2%的藻酸钠凝胶组中直径增加最多（P＜0.05），荧光染色后，2%的藻酸钠凝胶组的未受损卵泡率较其他两组高，与0.5%藻酸钠凝胶组相比，差异有统计意义（P＜0.05），而与1%藻酸钠凝胶组相比无统计学差异（P＞0.05）。检测三组浓度不同的藻酸钠凝胶组中E2的水平发现，E2随着培养时间的延长分泌增多，同时也符合各组卵泡的增长趋势，2%的藻酸钠凝胶组中分泌的最多，与0.5%藻酸钠组比，其差异有统计学意义(P＜0.05），而与浓度为1%的藻酸钠组相比，其差异无统计学意义。<br>　　1、冷冻解冻过程对卵巢组织有一定的损伤，一部分初级卵泡和次级卵泡受损，但是对始基卵泡的活性影响较小。<br>　　2、玻璃化冷冻法和程序化冷冻法均能较好的保存卵巢组织内窦前卵泡的活性。<br>　　3、藻酸钠三维培养系统较二维培养系统更适合始基卵泡的生长。<br>　　4、浓度为2%的藻酸钠凝胶较低浓度的藻酸钠凝胶更适合始基卵泡的生长发育。