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摘要1.研究背景与目的：<br>　　JPH2基因编码的Junctophilin-2是心脏Junctophilins（JPs，JPHs）家族中参与形成膜耦联复合体的蛋白成员，是与心肌细胞内Ca2+信号操纵相关的蛋白分子。已有研究表明，小鼠JPH2敲除会导致其胚胎期致死，心脏出现不规则钙信号，以及与SR钙释放分离的异常收缩。表明JPH2在促进SR钙释放和心肌收缩中起着关键作用。在心肌肥大模型中，JPH2表达的下调与 L-型 Ca2+通道和RyR2之间的耦联缺陷有关。提示JPH2可能与细胞膜上电压门控钙离子通道和肌浆网膜ryanodine受体之间的功能耦联有关。<br>　　小电导-Ca2+-激活K+通道（small-conductance calcium-activated potassium channel SK，Kca2）属于非电压依赖性，几乎可表达在所有可兴奋细胞。根据对特异性阻断剂apamin敏感性的不同, SK通道可以被分为SK1，SK2，SK3和SK4四种亚型。SK1一般存在于神经组织中，SK2和SK3既存在于神经组织也存在于外周组织。作为钙激活的钾通道，心肌细胞上的 SK2通道对胞浆中的钙离子具有高度敏感性，可通过细胞内低钙离子浓度而被激活，从而整合Ca2+浓度和膜电位的变化。细胞内 Ca2+来源主要包括两条途径：通过电压门控 Ca2+通道（voltage-gated Ca2+channels，VGCCs）激活从细胞外进入细胞内的Ca2+及通过心肌肌质网（sarcoplasmic，SR）膜上的兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyRs）激活释放储存的Ca2+。之前，我们实验室已经论证了心肌RyR2敏感的Ca2+释放通道可以调控心肌 SK2通道介导的 Ca2+激活 K+（Ik,Ca）电流，但对 RyR2和SK2通道之间功能耦合的具体分子机制并不清楚。JPH2是否是心肌SK2通道与RyR2之间膜耦联的关键分子，目前尚不清楚。<br>　　本实验通过RNA干扰JPH2基因，并利用腺病毒介导构建Ad-JPH2-RNAi重组载体，转染新生小鼠心肌细胞，采用全细胞膜片钳研究了JPH2对SK2通道介导的 Ik,Ca电流的影响。通过给予 RyR2激动剂-Caffeine， RyR2抑制剂-Ryanodine，以及SR Ca2+ATP酶抑制剂-Thapsigargin，观察JPH2对心肌RyR2钙释放通道与SK2通道功能性耦联的影响。从而为揭示心脏SK通道分子调控、心脏疾病的预防策略提供可靠的实验依据。<br>　　2.材料方法：<br>　　1）本实验采用出生1-3天的 C57BL/6小鼠（合格证号为 SCXX（京）2012-0001），购于北京维通利华实验动物技术有限公司，雌雄不限。<br>　　2）用实验室已成功制备的JPH2-shRNA重组腺病毒表达载体转染原代培养的小鼠心肌细胞，将细胞分为3组：正常未转染病毒的对照组（Ctrl-NC）；转染无关序列腺病毒（Ad-scramble siRNA）对照组；转染 JPH2siRNA序列腺病毒（Ad-JPH2-siRNA）组。<br>　　3）采用Real-time PCR检测各组细胞提取的cDNA样本中JPH2mRNA相对量。<br>　　4）采用全细胞膜片钳记录感染心肌细胞SK2通道介导的Ca2+-激活K+电流（calcium-activated potassium current，Ik,Ca）的变化。将细胞分为3组：Ctrl-NC， Ad-scramble siRNA和Ad-JPH2-siRNA组。为探讨JPH2在SK通道与RyR2功能耦联中的作用，又将细胞分为4组：Ad-scramble siRNA，Ad-JPH2-siRNA， Ad-JPH2-siRNA+Ryanodine+TG以及Ad-JPH2-siRNA+Caffeine组。<br>　　5）统计学分析：利用统计软件SPSS17.0进行实验数据的统计和处理。采用单因素方差分析比较各组间的显著性差异。以α=0.05为检验水准，n表示样本例数。<br>　　3.结果：<br>　　1）采用Real-time PCR检测各组心肌细胞JPH2mRNA相对表达量。结果显示：与Ctrl-NC组细胞相比较，Ad-scramble siRNA组心肌细胞JPH2 mRNA水平无显著性差异；Ad-JPH2-siRNA组JPH2 mRNA的相对表达水平与对照组细胞相比较，显著降低，其干扰效率达到80-90％。<br>　　2）用全细胞膜片钳法记录 Ik,Ca电流结果显示：与 Ctrl-NC和 Ad-scramble siRNA组相比，Ad-JPH2-siRNA组心肌细胞膜SK2通道Ik,Ca电流显著减小；预先给予RyR2受体抑制剂Ryanodine+ TG，与Ad-scramble siRNA组相比较，SK2通道介导的 Ik,Ca电流被明显抑制；与 Ad-JPH2-siRNA组比较，Ik,Ca电流有减小的趋势，但组间差异无显著性。给予RyR2受体激动剂Caffeine，与Ad-scramble siRNA组相比较，Ik,Ca电流显著减小，与Ad-JPH2-siRNA组比较，Ik,Ca电流增大。<br>　　4.小结：<br>　　siRNA敲减小鼠心肌细胞JPH2可显著抑制心肌细胞JPH2 mRNA的表达，抑制SK2通道Ik,Ca电流；JPH2可通过RyR2 Ca2+释放通道调节SK2通道介导的Ik,Ca。提示JPH2介导了心肌SK2通道和RyR2之间的功能耦联。