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摘要研究背景:消毒是控制病原微生物传播的主要措施，已广泛应用于人们的日常生活、医院、食品加工、日化用品和畜牧水产养殖等方面，但伴随而来的细菌对消毒剂的抗性问题也引起了人们的重视。细菌对消毒剂产生抗性后，会出现选择性细菌，即具有强的适应性和抵抗力的细菌得以存活，从而出现更难以控制和治愈的感染，消毒剂抗性菌已是导致医院院内感染的主要因素。消毒剂抗性菌是指对常用消毒剂浓度不再敏感的菌株，也就是即在可以杀灭或抑制绝大部分细菌的消毒剂浓度下，消毒剂抗性菌却不能被杀灭或抑制。一般以分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）或最小杀菌浓度（MBC）与标准菌株的MIC或MBC对比进行判定。<br>　　细菌对消毒剂产生抗性的机理主要包括固有性抗性和获得性抗性两个方面。固有性抗性主要是由细菌自身的某些结构或性能所决定的，例如细菌芽孢可以阻止消毒剂进入细菌体内，革兰氏阴性菌因为其细胞壁结构与革兰氏阳性菌不同而对消毒剂表现更强的耐受。获得性抗性是指细菌从环境中获得了某些消毒剂抗性基因，并且这些消毒剂抗性基因在细菌体内表达而导致对消毒剂的抗性。消毒剂抗性基因按其表达方式主要分为质粒介导表达和染色体介导表达两类。目前，对消毒剂抗性基因研究较多的是 QAC基因家族，研究发现有八种 QAC基因可以由质粒介导表达，包括 qacA/B、qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI以及sugE(p)，这些基因可以在细菌之间水平和垂直传播。染色体介导表达的抗性基因 sugE(c)、emrE、ydgE/ydgF、mdfA，赋予了细菌对 QACs的抗性。消毒剂抗性基因可以在细菌之间接合转移，其对环境微生物安全的影响不容忽视。<br>　　研究目的:本论文将以水环境微生物安全评价常用指标菌——大肠杆菌为对照，以常用消毒剂——次氯酸钠、碘伏和苯扎溴铵为研究对象，针对天津海河流域开展消毒剂抗性菌抗性水平评估，并分析消毒剂抗性菌的生物谱，了解主要消毒剂抗性基因的污染水平，为消毒剂抗性菌的环境安全评价提供参考依据。<br>　　研究方法:<br>　　1.天津海河流域水环境中消毒剂抗性菌抗性水平评估：选择天津海河流域不同地点采样，以大肠杆菌ATCC25922为对照，选取次氯酸钠、碘伏、苯扎溴铵3种消毒剂，通过MIC和MBC试验，开展消毒剂抗性菌的抗性水平研究，并利用PCR技术分析典型消毒剂抗性基因在消毒剂抗性菌中的检出情况。<br>　　2.天津海河流域水环境中消毒剂抗性菌生物谱分析：针对天津海河流域不同断面采样点的水样，对MIC和MBC试验样品中最高消毒剂浓度下存活的抗性菌，利用16S rRNA扩增子测序技术，分析不同水样对3种消毒剂的MIC和MBC试验样品中消毒剂抗性菌的生物谱。<br>　　3.天津海河流域水环境中典型消毒剂抗性基因污染水平调查：正压抽滤方法浓集水样中细菌，利用试剂盒提取细菌基因组DNA，通过实时荧光定量PCR技术，采用SYBR GREEN染料法，对样品中典型消毒剂抗性基因进行定量检测。<br>　　研究结果:<br>　　1.天津海河流域水环境中消毒剂抗性菌抗性水平：ATCC25922对次氯酸钠的MIC和MBC均为250 mg/L，碘伏MIC为90 mg/L，MBC在90～120 mg/L，苯扎溴铵MIC和MBC均为60 mg/L。而各采样点的次氯酸钠MIC和MBC在850～1350 mg/L，碘伏MIC和MBC在120～270 mg/L，苯扎溴铵除南运河外其他采样点MIC和MBC在90～270mg/L，均高于对照菌株。而在24个MIC样品中，qacA/B和qacG基因均未检出；qacEΔ1基因检出率为（10/24），qacE、emrE基因检出率为（3/24），sugE(p)基因检出率为（2/24），sugE(c)检出率为（6/24），ydgE/ydgF检出率为（7/24）。<br>　　2.天津海河流域消毒剂抗性菌的生物谱分析：在次氯酸钠、碘伏和苯扎溴铵共计38个MIC和MBC样品中，变形菌门和厚壁菌门检出相对较多。在南运河碘伏MIC中检测到较高丰度的蓝藻门和放线菌门，金刚桥苯扎溴铵MIC中也检测到一定丰度的放线菌门。<br>　　次氯酸钠MIC和MBC样品中，检出频率相对较多的种属有：芽孢杆菌属、假单胞菌属、Jeotgalibacillus属、枝芽孢杆菌属以及赖氨酸芽孢杆菌属。碘伏MIC和MBC样品中，相对丰度较高的种属有：假单胞菌属、芽孢杆菌属、气单胞菌属、Synechococcus属、乳酸杆菌属。苯扎溴铵MIC和MBC样品中，相对丰度较高的种属有：假单胞菌属、气单胞菌属、普罗维登斯菌属、摩根菌属、芽孢杆菌属。<br>　　3.天津海河流域水环境中消毒剂抗性基因污染情况：水样中季铵盐类消毒剂抗性基因qacE、qacE△1和qacG基因在8个采样点均有检出，而qacA/B基因在8个采样点均未检出，ydgE和ydgF基因在上、中游采样点均有检出，sugE(c)、sugE(p)和emrE基因在南运河、金刚桥、大光明桥和外环路4个采样点检测为阳性。<br>　　qacE和qacE△1基因定量结果达到102-104拷贝/mL，qacG基因达到102-103拷贝/mL。染色体型消毒剂抗性基因sugE(p)、sugE(c)、emrE可以达到100～103拷贝/mL，而ydgE和ydgF基因达到101～102拷贝/mL。<br>　　研究结论:与水环境标准中规定的大肠杆菌相比较，天津海河流域水环境中的细菌对常见消毒剂的抗性水平较高，其中包括变形菌门、厚壁菌门、蓝藻门和放线菌门等门的细菌。而芽孢杆菌和假单胞菌在抗性菌中丰度相对较高，另外，在上游采样点还发现有气单胞菌、普罗维登斯菌和摩根菌等条件致病菌。天津海河流域水环境中细菌季铵盐类消毒剂抗性基因存在一定的携带率，其中可移动元件介导的消毒剂抗性基因较高。