• 医学文献
  • 知识库
  • 评价分析
  • 全部
  • 中外期刊
  • 学位
  • 会议
  • 专利
  • 成果
  • 标准
  • 法规
  • 临床诊疗知识库
  • 中医药知识库
  • 机构
  • 作者
热搜词:
换一批
论文 期刊
取消
高级检索

检索历史 清除

医学文献>>
  • 全部
  • 中外期刊
  • 学位
  • 会议
  • 专利
  • 成果
  • 标准
  • 法规
知识库 >>
  • 临床诊疗知识库
  • 中医药知识库
评价分析 >>
  • 机构
  • 作者
热搜词:
换一批

MicroRNA-21/145和pSmad3C/3L在肝细胞癌中的交互作用机制研究

摘要原发性肝癌是当今社会人类癌症死亡的第三大原因,也是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率仅次于胃癌和食道癌。其中,肝细胞癌(HCC, Hepatocellular Carcinoma)约占原发性肝癌的90%。HCC由于其发病隐匿,生存周期短,预后差,死亡率高而成为目前研究的热点领域之一。尽管分子靶向药物增加了 HCC患者的生存周期,但HCC治疗仍面临着巨大挑战。现有研究认为,HCC发生发展关联到多种信号通路失调,其中包括 TGF-β/Smad,它直接或间接地与microRNAs相互作用并在癌变过程中担任着重要角色。研究认为,microRNA-21在HCC中表达上调,而microRNA-145在HCC中表达下调,但是它们的异常表达是如何与TGF-β/Smad信号通路下游Smad3蛋白特定结合域磷酸化相互关联,还是未知的。本研究在此基础上,探究Smad3C末端(pSmad3C)和连接区磷酸化(pSmad3L)与microRNA-21和microRNA-145在HCC中的相互作用以及对HCC进展影响的作用机制。<br>  目的:<br>  1.建立裸鼠移植瘤模型,采用agomir/antagomir分别在裸鼠移植瘤中干预miR-21和miR-145的表达,观察分别下调microRNA-21和上调microRNA-145对肿瘤生长及肿瘤细胞凋亡的影响。<br>  2.分别将选择性上调 pSmad3C或 pSmad3L蛋白水平的稳转细胞株(Smad3 EPSM,Smad33S-A)接种到裸鼠体内,建立肝细胞癌移植瘤模型,观察分别上调pSmad3C和pSmad3L蛋白水平对肿瘤生长和肿瘤细胞凋亡的影响。<br>  3.在肝细胞癌移植瘤模型中,检测下调microRNA-21表达或上调microRNA-145表达对pSmad3C和pSmad3L蛋白水平的影响;<br>  4.在分别选择性上调 pSmad3C和 pSmad3L蛋白水平的裸鼠移植瘤模型中检测microRNA-21和microRNA-145表达。<br>  5.探究在HCC中microRNA-21/145和pSmad3C/3L的相互作用以及对HCC进展的影响。<br>  方法:<br>  1.整体动物实验:<br>  实验一:雄性BALB/c裸鼠24只,3-5周龄,14-18g,适应性饲养一周。选取状态良好,对数生长期的 HepG2细胞,调细胞密度至4.5×107细胞/ml,每只裸鼠接种0.2ml,每只裸鼠接种细胞数量9×106。分别向各组裸鼠皮下接种HepG2细胞,待皮下形成明显瘤块后,按瘤体积均分为4组(n=6):miR-21 antagomirNC组,miR-21 antagomir组,miR-145 agomirNC组和miR-145 agomir组。分别向瘤体内注射20μl miR-21antagomirNC,miR-21 antagomir,miR-145 agomirNC和miR-145 agomir,每4天注射1次,注射7次后取材。28天后,处死动物,取出瘤块,排水法测量瘤体积,Western-blot和免疫组织化学方法检测瘤体中pSmad3C、pSmad3L和Smad3、Smad4的表达情况,HE染色检测细胞病理学改变,透射电镜检测细胞凋亡情况。<br>  雄性BALB/c裸鼠24只,3-5周龄,14-18g,适应性饲养一周。随机分为四组(n=6):HepG2组,WT组,EPSM组和3S-A组。分别向裸鼠皮下接种稳转HepG2细胞的Smad3 WT,Smad3 EPSM和Smad33S-A细胞(细胞数9×106),待皮下形成明显瘤块后,每4天1次测量肿瘤体积。28天后,处死动物,取出皮下瘤块,测量瘤重瘤体积。Western-blot法检测瘤组织中pSmad3C,pSmad3L和 Smad3蛋白表达情况;HE染色和透射电镜检测细胞凋亡情况;qRT-PCR法检测各组中microRNA-21/145的表达情况。<br>  2.体外细胞实验:<br>  体外常规培养 HepG2细胞,传代培养,选取生长状态良好,对数生长期的细胞,待培养瓶中细胞长至单层铺展面积达90%-95%时,弃培养液,每瓶加胰酶消化(1 ml,17℃,2 min),加DMEM混悬细胞(1.5 ml),转移至10 ml管中(四瓶细胞),离心沉淀细胞(低速离心机,1500转,5 min),弃上清,加PBS混悬细胞。调细胞密度至4.5×107细胞/ml,每只裸鼠接种0.2 ml,每只裸鼠接种细胞数量9×106。向HepG2细胞中转染miR-21 antagomir/NC和miR-145 agomir/NC,体外检测pSmad3C/3L表达。<br>  体外培养 HepG2细胞,使用脂质体稳定转染法将三种质粒 Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad33S-A转入HepG2细胞中,经G418(600?g/ml)筛选,获得稳定表达转染质粒特性的三种稳转细胞株(Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad33S-A)。qRT-PCR检测各细胞中micrRNA-21/145表达情况。<br>  结果:<br>  1.下调的microRNA-21和上调的microRNA-145表达分别抑制HCC肿瘤体积生长并促进肿瘤细胞凋亡<br>  肿瘤负荷和肿瘤细胞存活是癌症的两个重要的标志性表型,并且它们与失调的TGF-?信号传导有关。使用免疫缺陷动物(包括BALB/c裸鼠)可以实现肿瘤细胞异种移植。这种肿瘤模型可以用于研究癌症表型以及潜在的失调的细胞信号转导机制。为了研究miR-21和miR-145在HCC肿瘤生长和肿瘤细胞凋亡中的作用,我们采用了向建立的 HCC移植瘤模型中注射 miR-21 antagomir和miR-145 agomir的方法来干预miR-21和miR-145表达。与miR-21 antagomirNC组相比,miR-21 antagomir组肿瘤体积减小;与miR-145 agomirNC相比,miR-145 agomir组肿瘤体积显著减小(P<0.01);肿瘤细胞形态上,与对照组相比,miR-21 antagomir组和miR-145 agomir组可见明显的细胞核皱缩,颜色加深;透射电镜检测细胞凋亡情况,可见miR-21 antagomir组和miR-145 agomir组肿瘤细胞凋亡程度明显增加。<br>  2. HCC中,分别下调 microRNA-21和上调 microRNA-145表达对 pSmad3C/3L表达的影响<br>  鉴于已有研究表明,MAPK和TβRI分别对Smad3C和Smad3L磷酸化发挥重要作用,我们想要进一步研究这种作用是否与 miR-21和 miR-145表达有关。然而,与NC组相比,miR-21 antagomir组pSmad3C/3L表达没有明显变化;但是与miR-145 agomirNC组相比,miR-145 agomir组pSmad3C蛋白水平明显上调(P<0.01)而pSmad3L蛋白水平则显著降低(P<0.01)。<br>  3.在HCC中分别特定高表达pSmad3C/3L对microRNA-21和microRNA-145表达的影响<br>  分别向HepG2细胞中转染Smad3 WT,Smad3 EPSM,Smad33S-A,获得稳定表达质粒特性的稳转细胞株。分别向裸鼠皮下接种三种稳转细胞,由结果可知,与WT组相比,EPSM组裸鼠肿瘤体积明显减小(P<0.01),相反,3S-A组肿瘤体积显著增加(P<0.01)。与瘤体积变化一致的是,EPSM组 pSmad3L蛋白水平显著增高而3S-A组pSmad3L蛋白水平则明显增加,pSmad3C蛋白水平情况则与 pSmad3L相反。细胞形态上,WT组肿瘤细胞大小不一、形态变异大、排列疏松,核大而不规则、核分裂象多;EPSM组瘤块细胞大小接近正常、形态较为规则、呈索梁状排列,核圆较为规则、核分裂象较少;3S-A组瘤块细胞大而不规则、排列松散紊乱,核大而深染、核分裂象多。电镜检测显示,WT组肿瘤细胞生长旺盛,胞浆中可见大量线粒体分布,细胞核大而染色质密集;EPSM组肿瘤细胞大小适中、细胞核稍有固缩、核仁较小;3S-A组肿瘤细胞中可见大量线粒体及发达的内质网结构,细胞核异形明显,分裂象多。qRT-PCR结果显示,与WT组相比,EPSM组瘤块中miR-145表达显著升高(P<0.01)而miR-21表达明显降低(P<0.01),3S-A组瘤块中miR-145表达显著降低(P<0.01)而miR-21表达明显降低(P<0.01)。<br>  结论:<br>  1.在HCC中下调miR-21表达或上调miR-145表达抑制肿瘤体积生长并促进肿瘤细胞凋亡。<br>  2.在 HCC中上调 miR-145表达显著升高 pSmad3C而降低 pSmad3L。HCC中miR-145可以促进肿瘤促进信号pSmad3L向抑癌信号pSmad3C的转换。<br>  3.在HCC中pSmad3C蛋白水平增高抑制肿瘤体积生长并促进肿瘤细胞凋亡;而pSmad3L蛋白水平增高则促进肿瘤生长并抑制肿瘤细胞凋亡。<br>  4.在HCC中pSmad3C表达增高引起miR-21表达降低而miR-145表达升高;而pSmad3L表达增加则引起miR-21表达升高而miR-145表达升高。<br>  5.在HCC中miR-21/145与pSmad3C/3L存在交互作用且共同影响肿瘤进程。

更多
广告
  • 浏览0
  • 下载0

加载中!

相似文献

  • 中文期刊
  • 外文期刊
  • 学位论文
  • 会议论文

加载中!

加载中!

加载中!

加载中!

特别提示:本网站仅提供医学学术资源服务,不销售任何药品和器械,有关药品和器械的销售信息,请查阅其他网站。

  • 客服热线:4000-115-888 转3 (周一至周五:8:00至17:00)

  • |
  • 客服邮箱:yiyao@wanfangdata.com.cn

  • 违法和不良信息举报电话:4000-115-888,举报邮箱:problem@wanfangdata.com.cn,举报专区

官方微信
万方医学小程序
new翻译 充值 订阅 收藏 移动端

官方微信

万方医学小程序

使用
帮助
Alternate Text
调查问卷