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摘要研究背景：<br>　　糖尿病正在不断地给人类健康带来严重的威胁，并且其发病率仍在逐年上升，每年死于糖尿病的患者也在不断增加。我国是世界上面临糖尿病威胁最大的国家，拥有糖尿病患者1.1亿人，每年约有100万人死于糖尿病。糖尿病是心血管疾病的最重要的危险因素，且心血管并发症是糖尿病患者的首要死因。研究证实，糖尿病患者心血管疾病的发生率及死亡率显著高于非糖尿病人群。以往的研究将这一作用归结于高糖因素。然而，临床研究表明，强化血糖控制并不能有效改善糖尿病患者的心血管并发症。因此，探索糖尿病相关的其他心血管疾病危险因素，对于控制糖尿病患者心血管并发症及改善糖尿病患者的生活极为重要。<br>　　支链氨基酸（BCAA）为机体必需氨基酸，是机体蛋白质合成必要原料及调节信号。BCAA还参与细胞增殖、细胞凋亡、氧化应激及细胞自噬等众多重要生命活动的调节。此外，早在1976年，发表于JCI的研究就发现，糖尿病患者血浆BCAA水平显著高于非糖尿病患者。研究还发现，心衰患者的血浆BCAA升高，同时，降低心衰小鼠的支链氨基酸水平后，可减缓其心衰进展。这些研究提示，BCAA代谢的异常，或许是糖尿病导致心血管疾病加重的重要原因。<br>　　另有研究结果显示，BCAA及其代谢中间产物的堆积，可降低抗氧化系统的功能，促进神经细胞的凋亡，导致神经系统的损伤。此外，在肝细胞中，BCAA能够抑制mTORC1、mTORC2及Akt的活性而导致细胞凋亡。Akt在胚胎期心肌的生长，高血压导致的心肌肥厚及心衰过程中都起着极为重要的作用。另有实验证明，抑制了mTORC2活性，可显著促进小鼠心衰的进展。由此，我们推测， BCAA代谢障碍可能是糖尿病患者心血管疾病中心脏损伤加重的原因，其机制可能是降低其抗氧化系统的功能路或抑制mTORC2-Akt通路。<br>　　研究目的：<br>　　1研究支链氨基酸（BCAA）代谢紊乱与糖尿病相关的心肌缺血/再灌注损伤加重之间的关系及探索其潜在机制。<br>　　2阐明BCAA代谢紊乱对高负荷诱导的心肌细胞凋亡的影响并探索其机制。<br>　　研究方法：<br>　　1支链氨基酸代谢紊乱是否参与糖尿病相关的心肌缺血/再灌注损伤加重及相关机制研究<br>　　1.1用高脂饮食喂养并间歇低剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法，诱导2型糖尿病（T2DM）小鼠模型。<br>　　1.2糖耐量实验（GTT）和胰岛素耐量实验（TTC）检测小鼠胰岛素抵抗。<br>　　1.3建立小鼠心肌缺血/再灌注模型：用异氟烷吸入的方法麻醉小鼠，切开心前区皮肤及肋间肌，结扎小鼠冠脉左前降支，40分钟后松开。<br>　　1.4心肌点注射腺病毒特意的在心脏过表达目的基因。<br>　　1.5小动物超声观察小鼠心功能。<br>　　1.6伊文氏蓝/TTC染色检测缺血/再灌注后心脏的梗死面积。<br>　　1.7 BCAA定量试剂盒检测血浆及组织匀浆中BCAA水平。<br>　　1.8 DHE染色检测组织及细胞中ROS含量。<br>　　1.9 TUNNEL染色和caspase-3活性检测试剂盒检测组织中的细胞凋亡。<br>　　1.10透射电子显微镜观察心肌线粒体损伤。<br>　　1.11 H9C2细胞系的培养及处理。<br>　　1.12用H9C2缺氧复氧体外模拟心肌缺血/再灌注。<br>　　2探索支链氨基酸（BCAA）代谢紊乱对异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌细胞凋亡的影响<br>　　2.1分离和培养小鼠原代心肌细胞。<br>　　2.2异丙肾上腺素（ISO）诱导心肌细胞凋亡。<br>　　2.3 CCK-8试剂盒检测细胞活性。<br>　　2.4 TUNNEL染色和caspase-3活性试剂盒检测细胞凋亡。<br>　　2.5 Western-blot检测目的蛋白的丰度。<br>　　2.6质粒转染过表达目的基因。<br>　　研究结果：<br>　　1支链氨基酸代谢紊乱通过下调MnSOD蛋白的表达和加重氧化应激参与糖尿病相关的心肌缺血/再灌注损伤加重<br>　　1.1糖尿病小鼠的心肌组织PP2Cm蛋白表达水平下调。<br>　　1.2心肌点注射腺病毒过表达PP2Cm，可降低糖尿病对心肌缺血/再灌注的加重作用。<br>　　1.3与野生型（WT）小鼠相比，PP2Cm敲除（PP2Cm-KO）小鼠心肌缺血/再灌注损伤显著加重。<br>　　1.4糖尿病小鼠心脏BCAA代谢功能障碍，心脏组织中BCAA及BCKA堆积。1.5用药物干预的方法改善糖尿病的BCAA代谢障碍后，其心肌缺血/再灌注损伤显著改善。<br>　　1.6药物干预治疗PP2Cm-KO小鼠的BCAA代谢紊乱，其与WT小鼠之间的缺血/再灌注损伤差异减小。<br>　　1.7与WT小鼠相比，PP2Cm-KO小鼠心肌缺血/再灌注后缺血边缘区心肌细胞凋亡增加。<br>　　1.8与WT小鼠相比，PP2Cm-KO小鼠心肌MnSOD蛋白表达水平显著下降；在心肌缺血/再灌注后，PP2Cm-KO小鼠ROS生成显著高于WT小鼠。<br>　　1.9用丙酮酸脱氢酶激酶（BCKDK）的抑制剂（BT2）干预纠正PP2Cm-KO小鼠的BCAA代谢障碍，能恢复其心肌MnSOD蛋白表达水平；在心肌缺血/再灌注后，治疗后的PP2Cm-KO小鼠（PP2Cm-KO+BT2）ROS生成量较未治疗的PP2Cm-KO小鼠（PP2Cm-KO+Vehicle）显著减少，线粒体损伤显著减轻。<br>　　1.10 BCKA孵育能下调H9C2细胞MnSOD蛋白的表达，增加 H9C2细胞的缺氧复氧后ROS的生成，促进细胞凋亡，降低存活率。<br>　　2探索支链氨基酸（BCAA）代谢紊乱对异丙肾上腺素（ISO）诱导的心肌细胞凋亡的影响<br>　　2.1 BCKA孵育能够增加ISO诱导的心肌细胞凋亡，降低其存活。<br>　　2.2 BCKA能够抑制降低mTORC2复合物的关键组成分子rictor的表达，降低mTORC2的酶活性，从而抑制心肌细胞中Akt的激活。<br>　　2.3过表达rictor蛋白以抵抗BCKA对心肌rictor的下调作用，增加mTORC2的酶活性，可抑制BCKA对心肌凋亡的促进作用。<br>　　结论：<br>　　1.2型糖尿病小鼠心肌BCAA代谢紊乱，是糖尿病相关的心肌缺血/再灌注损伤加重的原因，其机制是：BCAA及其代谢中间产物降低了心肌抗氧化酶<br>　　MnSOD蛋白的表达，增加氧化应激和细胞凋亡。<br>　　2. BCAA代谢中间产物BCKA能通过抑制mTORC2-Akt信号轴的活性，加重心肌细胞对ISO诱导的细胞凋亡的敏感性。