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摘要随着我国进入老龄化社会和全民对口腔健康重视程度的不断提升，人们对口腔种植体修复缺失牙齿以提高生活质量的需求日趋增加。虽然目前成品生产的种植体骨结合较好，但骨结合周期较长，难以满足早期或即刻修复，所以缩短种植体骨结合周期是目前种植体研究的热点[1]。在缩短种植体愈合周期，获得早期和更高的骨结合强度的多种途径中，骨植入材料材料表面微纳米仿生优化被认为是一种具有较大研究前景的方法。本研究中先HF酸蚀再进一步采用阳极氧化方法形成与天然骨组织形貌更相似的微纳米复合梯度形貌。课题组前期体外实验证实该形貌能够促进成rBMSCs的多项生物学功能，但是涉及的具体机制目前还不清楚。因此，探明骨植入材料表面形貌对细胞及组织的影响机制，将为骨植入材料的表面优化设计提供分子生物学依据。<br>　　本研究首先制备微纳米形貌试样并对材料表面微观结构与性状分析，原代培养rBMSCs并完成鉴定；然后应用rBMSCs细胞，评价不同微纳米形貌对rBMSCs细胞粘附、增殖、形态、骨架形态和成骨分化功能影响的研究；最后检测不同微纳米形貌表面rBMSCs细胞内 Rac1、Cdc42、RhoA及Wnt/β-catenin相关通路蛋白的活性。通过免疫荧光、western blot及实时定量 RCR检测，明确并梳理不同试样微纳米形貌表面rBMSCs细胞内 Rho GTPases家族、Wnt/β-catenin及MAPK相关通路关键蛋白之间关系的分子网络调控机制，为相关材料的表面优化研究提供指导。<br>　　第一部分试样表面形貌制备分析与rBMSCs培养与鉴定<br>　　目的：构建微纳米形貌试样并进行表面结构与性状分析，对rBMSCs进行原代培养及鉴定，为后续实验提供基础。<br>　　方法：HF酸蚀在纯钛表面形成微米坑形貌后采用阳极氧化方法在微米坑基础上形成均匀的TiO2纳米管结构并结合SEM、AFM及接触角测量仪进行表面结构与性状分析。rBMSCs原代培养并检测rBMSCs的生长曲线、细胞克隆形成及成脂成骨分化情况。<br>　　结果：SEM下微纳米形貌试样表面明显可见分布相对均匀的纳米管结构。S、R、R5及R20组试样表面接触角测量值平均值由58.6°逐渐降到3.8°。培养的rBMSCs具有增殖、克隆形成及成脂成骨分化能力。<br>　　结论：制备微纳米形貌试样及培养的rBMSCs是符合实验要求的。<br>　　第二部分微纳米形貌对rBMSCs形态与功能的影响<br>　　目的：观察不同形貌表面对rBMSCs形态与功能的影响。<br>　　方法：通过在微纳米形貌表面进行细胞黏附计数、活力测定、细胞形态及细胞骨架观察、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等检测评价微纳米形貌对rBMSCs形态与成骨分化功能的影响。<br>　　结果：细胞黏附计数、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等方面，R5及R20组明显优于对照组，而R5及R20组细胞活力与对照组相比，3天、7天时均无明显变化。微纳米形貌表面rBMSCs更为伸展，且板状与丝状伪足更加明显。同时在共聚焦显微镜下微纳米形貌表面细胞胞浆内红色纤维网状结构更多更清晰。<br>　　结论：钛种植体表面微纳米形貌不仅显著改变了骨髓间充质干细胞表面粘附能力、形态及骨架，而且较大地促进rBMSCs成骨分化能力。<br>　　第三部分微纳米形貌通过Cdc42/Wnt/-catenin通路对rBMSCs调控的研究<br>　　目的：探索可能存在的微纳米形貌调控 rBMSCs形态与功能变化的机制，为材料表面优化设计提供研究依据和新思路。<br>　　方法：通过对比 Cdc42siRNA转染前后进行细胞形态及细胞骨架观察、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等检测评价微纳米形貌表面 Cdc42介导对 rBMSCs形态与成骨分化功能的调控作用。采用实时定量 PCR及Western blot方法检测Cdc42对Wnt/-catenin的影响。<br>　　结果：相对于Cdc42siRNA转染前，转染后微纳米形貌表面rBMSCs细胞黏附计数、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等均明显下降，微纳米形貌表面细胞处于相对萎缩状态，丝状伪足和板状伪足明显减少，在共聚焦显微镜下胞浆内红色纤维网状结构染色明显减弱。Cdc42siRNA转染大大降低了微纳米形貌表面β-catenin mRNA表达（P＜0.05），同时Cdc42siRNA转染明显抑制了R5及R20组表面Nucleusβ-catenin及p-GSK3β蛋白表达。R5及R20组明显促进了Wnt1、Wnt3a及整合素Integinβ1、Integrinβ3和Integrinβ6的mRNA表达<br>　　结论：微纳米形貌通过Cdc42/Wnt/-catenin通路参与调控rBMSCs形态及成骨分化功能。<br>　　第四部分微纳米形貌通过Rac1/MAPK通路对rBMSCs调控研究<br>　　目的：探索可能存在的 Rac1与MAPK信号通路间串联调节是材料微纳米形貌表面的另一个分子调控机制，为材料表面优化设计提供研究依据和新思路。<br>　　方法：通过对比Rac1siRNA转染前后进行细胞形态及细胞骨架观察、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等检测评价微纳米形貌表面Rac1介导对rBMSCs形态与成骨分化功能的调控作用。采用PCR及Western blot检测Rac1对MAPK通路的影响。<br>　　结果：微纳米形貌表面显著上调了Rac1、p-ERK1/2、p-p38表达水平,而未检测到JNK相关蛋白的表达。Rac1siRNA转染后微纳米形貌表面rBMSCs片状伪足数量和长度均减少、胞浆内纤维网状结构显著减少、特异性抗体Rac1的免疫荧光强度明显减弱。相比于野生型，Rac1siRNA显著抑制微纳米形貌表面碱性磷酸酶合成、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨相关基因的表达。Western blot结果显示Rac1siRNA转染明显抑制了R5及R20组表面p-p38和p-ERK1/2的蛋白表达，而试样表面t-p38和t-ERK1/2的表达水平无明显改变。<br>　　结论：微纳米形貌通过Rac1/MAPK通路参与调控rBMSCs形态及成骨分化功能。