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摘要研究背景：<br>　　心血管疾病为危害人类健康的第一杀手，2015年中国心血管病报告显示，脑血管疾病及冠状动脉粥样硬化性心脏病死亡率分别居我国居民疾病死亡构成首位及第二位，这两种疾病均与动脉粥样硬化关系密切。动脉粥样硬化易损斑块极易在各种诱因诱导下触发急性心血管事件，其发病急，病情进展迅速，院外患者常因未能得到及时诊治遗留不可逆性器官损伤，严重降低公众生存质量。因此，急性心血管事件的预防成为亟待解决的公众健康难题。当前临床主要采用 CTCA及介入造影从解剖学角度评价动脉管腔狭窄程度，评估斑块风险，指导临床治疗。通常临床诊疗以血管狭窄超过75％作为手术干预节点，而尸检结果显示，多数急性梗塞由管腔狭窄小于50%的动脉粥样硬化斑块引起。因此，传统的基于血管解剖学结构的诊疗手段并不能高效的预估斑块风险。新兴的分子影像学技术从病理生理学角度出发，在分子生物学水平对生物体内环境变化进行识别和量化，近年来在更加精细化的诊断及治疗中呈现出不错的应用前景。<br>　　分子影像学探针主要由特异的靶向性分子及成像材料构成。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种磷酸化糖蛋白，研究证实动脉粥样硬化发生时，斑块成分泡沫细胞和表型转换的平滑肌细胞中OPN表达均明显上调。而泡沫细胞形成的巨大坏死物核心和薄纤维帽均为易损斑块极强的预测因素之一，因此OPN有希望作为有效的靶点识别不稳定斑块。高聚物材料由于毒性小、可修饰性佳，近年来在生物工程领域得到广泛关注。液态氟碳类材料具有优良的稳定性及携氧能力，由于其密度大，可通过聚集效应实现超声造影。<br>　　本研究以 OPN为靶点，以包裹液态氟碳全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide,PFOB)的高聚物聚乳酸(poly lactic acid,PLA)纳米颗粒作为超声对比剂，于抗体上标记荧光染料Cy5.5,构建靶向OPN的超声/荧光双模态纳米探针，以期实现对不稳定斑块的识别，从而为临床急性心血管事件的评估与预防提供新思路。<br>　　研究目的：<br>　　构建 OPN靶向的超声/荧光双模态纳米探针 Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB，验证纳米探针的敏感性、特异性及双模态成像能力，并对探针的稳定性及细胞生物相容性进行评估。<br>　　研究方法：<br>　　1.以乳化溶剂挥发法制备包裹PFOB的PLA纳米颗粒,5000g离心5min收集沉淀。以NHS和EDC作为催化剂，在MES缓冲液中活化纳米颗粒表面羧基，PBS缓冲液中与聚乙二醇衍生物NH2-PEG-mal通过氨基羧基反应对纳米颗粒进行亲水性修饰。以还原剂 TCEP打开抗体二硫键暴露巯基，与聚乙二醇尾端的马来酰亚胺基通过点击反应偶联，得到 Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB。通过透射电镜、红外光谱、动态光散射仪、荧光光度计对纳米颗粒进行表征，乳胶管水浴超声观察纳米颗粒的成像能力。<br>　　2.以 RAW264.7小鼠单核巨噬细胞系及 MOVAS小鼠主动脉平滑肌细胞系作为细胞模型，通过氧化低密度脂蛋白孵育，模拟动脉粥样硬化斑块成分，在细胞水平观察OPN的表达变化。以不同浓度的材料与细胞共孵育，探究所构建纳米颗粒的生物学毒性。将纳米探针与泡沫细胞共孵育，观察纳米探针的体外寻靶能力，分别设加入靶向OPN纳米颗粒的实验组、同时加入靶向纳米颗粒和大量OPN抗体的竞争抑制组、连接非特异性抗体的IgG纳米颗粒组。<br>　　3.以高脂饲料喂养的 ApoE-/-敲除小鼠构建动脉粥样硬化动物模型，通过大体解剖及组织病理切片染色对动物模型进行鉴定。通过对连续病理切片的 OPN、巨噬细胞标志物 CD68及平滑肌细胞标志物α-SMA免疫组织化学染色，观察斑块组织中OPN与巨噬细胞及平滑肌细胞分布的一致性。将标记染料的靶向抗体注射入小鼠体内，观察标记抗体对动脉粥样硬化斑块的识别能力。<br>　　研究结果：<br>　　1.成功构建了Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB纳米探针。经5000g离心优选后纳米颗粒粒径分布较均一，水合粒径在320nm至400nm之间，Zeta电位为-20.14±0.68mv。透射电镜观察PLA纳米颗粒，可见颗粒呈类圆形，多数颗粒粒径在200nm左右，表面光滑，未见明显的团聚及粘连现象。乳胶管超声成像示PLA纳米颗粒在PIHI模式下显示为点状密集高回声，在较高机械指数下信号无衰减。在光谱结果见Cy5.5的发射波长约为705.7nm。<br>　　2.细胞免疫荧光结果显示经低密度脂蛋白处理后OPN表达明显增加。CCK-8实验显示纳米颗粒在使用范围无显著细胞毒性。当探针浓度达到0.5mg/ml时，细胞活性仍大于80%。激光共聚焦显微镜下观察所构建纳米探针在泡沫细胞模型中的摄取情况，荧光半定量结果显示实验组OPN NPs摄取量显著高于竞争抑制组及无关对照组，探针靶向识别性能佳。<br>　　3.大体解剖见在血管分叉处、血流剪切应力改变显著的部位较易形成斑块。组织病理切片染色显示斑块内大量脂质沉积、坏死核心形成、纤维帽薄，免疫组织化学染色显示OPN在斑块内巨噬细胞及平滑肌细胞分布区域均有多量表达。标记抗体的在体荧光成像结果表明，OPN抗体较IgG抗体荧光信号显著增强，靶向性良好。研究结论：<br>　　OPN在泡沫细胞模型及平滑肌转换细胞模型中表达均明显上调，动脉粥样硬化斑块内OPN亦有多量表达。靶向OPN的PLA纳米颗粒性质稳定、生物相容性好、成像能力优良、可有效识别靶点。