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成年小鼠心肌缺血/再灌注损伤调节新机制:NR-SIRT3-p53/PGC-1α改善线粒体自噬及线粒体合成

摘要研究背景:<br>  心肌缺血/再灌注(I/R)损伤是一个十分复杂的过程,它能引起蛋白质、RNA、DN A和细胞膜损伤,从而导致细胞死亡和心输出量降低。而心脏作为高耗能器官且线粒体在心肌细胞中占据着30%的体积,线粒体功能紊乱已经成为心肌I/R损伤的一个重要致病因素。细胞内受损线粒体除了能产生过量的活性氧(ROS)以外,还能激活细胞死亡信号通路导致细胞死亡。因此,及时清除心肌细胞内功能紊乱的线粒体并合成健康的线粒体对维持心肌细胞存活是十分重要的。<br>  线粒体自噬是自噬的一种特殊形式,它主要包裹受损线粒体并将其运往溶酶体中降解,而PINK1和Parkin是线粒体自噬的标记分子。以往研究显示,线粒体自噬在多种神经退行性疾病中起着重要作用,然而,在心肌 I/R损伤或心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用尚未完全明确。<br>  线粒体合成是细胞内产生新的线粒体的过程。心肌线粒体合成受损将导致细胞抗氧化能力降低,能量产生减少,心脏舒张功能降低。以往研究表明心肌线粒体合成受损影响着心力衰竭和心肌肥厚的疾病进展,然而,在心肌 I/R损伤或心肌细胞H/R损伤中的作用尚未完全明确。<br>  烟酰胺核糖(NR)是新近发现的 NAD+的前体物质,它存在于牛奶中是一种维生素B3的类似物且在代谢调节过程中具有十分有利的作用。以往研究表明,NR能增强胰岛素的敏感性、促进线粒体合成、增强Sirtuin家族的功能。而Sirt3作为Sirtuin家族中一个重要成员,它定位于线粒体上且是高度保守的依赖N AD+的去乙酰化酶。Sirt3能去乙酰化线粒体上的多种蛋白,从而调节细胞的能量和代谢通路。然而 NR能否通过Sirt3进而调节线粒体自噬和线粒体合成从而改善心肌I/R损伤,目前尚不明确。<br>  研究目的:<br>  本研究拟从现象到机制,从动物和细胞两个水平明确 NR促进线粒体自噬及线粒体合成在心肌I/R损伤中的重要作用,并力图阐明相关分子机制。希望能够完善心肌I/R损伤发生发展的理论基础,并为治疗心肌I/R损伤患者提供新的思路。具体目标如下:<br>  1.动物水平:在明确NR对心肌I/R损伤潜在治疗作用的基础上,探索其与线粒体自噬及线粒体合成的关系,并力图通过药物干预和基因技术阐明其潜在的分子机制。<br>  2.细胞水平:在动物实验基础上,通过药物和基因技术干预小鼠心肌细胞H/R模型,进一步确定NR通过干预线粒体自噬及合成而减少H/R损伤的作用及相关分子通路。<br>  研究方法:<br>  自制鼠粮喂养成年小鼠三周,小鼠NR摄入量为400 mg/kg/d或Nutlin-3(p53激动剂)摄入量为400 mg/kg/d,三周后心肌点注射Sirt3或PGC-1α的小干扰RNA,三天后进行I/R模型构建,用二维超声心动图检测各组心功能指标,组织TUN EL检测心肌凋亡指数,伊文氏蓝/TTC双染法检测心肌梗死面积,组织电镜观察心肌自噬体数量变化,Western blot法检测Sirt3、p53、PGC-1α、Atg5、Atg7、Beclin1、p62、LC3、Nrf1、Tfam、mitoParkin、cytoParkin、mitoPINK1、cytoPINK1、Ac-p53和Ac-PGC-1α表达水平。采用Langendorff灌流法分离和培养成年小鼠心肌细胞72h,应用NR(50μmol/L)、p53激动剂(Nutlin-3,10μmol/L)、Sirt3小干扰RNA(siRNASirt3)、PGC-1α小干扰RNA(siRNAPGC-1α)分别干预成年小鼠心肌细胞,用细胞TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,JC-1检测心肌细胞线粒体膜电位,细胞电镜观察心肌细胞自噬体数量变化,Western blot法检测Sirt3、p53、PGC-1α、Atg5、Atg7、Beclin1、p62、LC3、Nrf1、Tfam、mitoParkin、cytoParkin、mitoPINK1、cytoPINK1、Ac-p53和Ac-PGC-1α表达水平。<br>  实验结果:<br>  1.在动物实验中,和假手术组对比,I/R损伤降低小鼠心功能指标、增加心肌梗死面积及心肌细胞凋亡指数;而和I/R组对比,加入NR后,增加小鼠心功能指标、减小心肌梗死面积及降低心肌细胞凋亡指数,且自噬标记分子、线粒体自噬标记分子和线粒体合成标记分子表达均增加。<br>  2.在动物实验中,与NR+I/R组对比,在此基础上干扰Sirt3后,NR保护作用减弱,表现为:小鼠心功能指标重新降低,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡指数重新增加,且自噬标记分子、线粒体自噬标记分子及线粒体合成标记分子表达均降低。<br>  3.在动物实验中,与NR+I/R组对比,在此基础上干扰PGC-1α后,NR保护作用减弱且线粒体合成标记分子表达降低,但自噬和线粒体自噬标记分子以及S ir t3表达量不变,表明Sirt3为PGC-1α上游,NR通过Sirt3促进线粒体合成改善I/R损伤。另外,与NR+I/R组对比,激动p53后,自噬和线粒体自噬标记分子表达升高,而Sirt3及线粒体合成标记分子表达量未变,表明Sirt3为p53上游,NR通过Sirt3促进线粒体自噬改善I/R损伤。<br>  4.在细胞实验中,和对照组对比,H/R损伤增加成年小鼠心肌细胞凋亡指数,降低线粒体膜电位;而和H/R组对比,加入NR后,心肌细胞凋亡指数降低,线粒体膜电位升高,且自噬标记分子、线粒体自噬标记分子和线粒体合成标记分子表达均增加。<br>  5.在细胞实验中,与NR+H/R组对比,在此基础上干扰Sirt3后,NR保护作用减弱,表现为:成年小鼠心肌细胞凋亡指数重新增加,线粒体膜电位重新降低,且自噬标记分子、线粒体自噬标记分子及线粒体合成标记分子表达均降低。<br>  6.在细胞实验中,与NR+H/R组对比,在此基础上干扰PGC-1α后,NR保护作用减弱且线粒体合成标记分子表达降低,但自噬和线粒体自噬标记分子以及S ir t3表达量不变,表明N R确实通过S irt3促进线粒体合成改善H/R损伤。另外,与NR+H/R组对比,激动p53后,自噬和线粒体自噬标记分子表达升高,而Sirt3及线粒体合成标记分子表达量未变,表明NR确实通过Sirt3促进线粒体自噬改善H/R损伤。<br>  实验结论:<br>  1.动物实验证实,NR对小鼠心肌I/R损伤具有保护作用,Sirt3是此过程中的关键分子。并进一步证实,NR通过 Sirt3-p53/PGC-1α一方面促进线粒体自噬,另一方面促进线粒体合成,最终改善心肌I/R损伤。<br>  2.细胞实验同样证实,NR确实通过Sirt3实现对心肌细胞H/R损伤的保护作用。而Sirt3—p53—线粒体自噬与Sirt3—PGC1α—线粒体合成是NR发挥其保护作用的重要机制。

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