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摘要随着分子生物学的发展，基因治疗已成为疾病治疗的重要手段，其应用范围越来越广泛，技术层面的可行性也不断提高。基因治疗通过导入外源基因，使细胞表达特定产物，从而起到治疗作用。其中，基因表达的调控是基因治疗的关键，通过控制产物的表达水平，能够在保证疗效的前提下，减少潜在的毒副作用，防止意外事件发生。目前的基因调控手段主要包括光诱导基因表达系统，四环素诱导基因表达系统以及电磁波诱导的基因表达系统等。虽然都能在一定程度上起作用，但有各自的局限性，比如处在研究前沿的光控基因表达，它虽然能够快速调控基因表达，但却不能到达深部组织，调控肝脏等深部器官的基因表达，起不到治疗效果。超声作为一种无创机械波源，可以穿过皮肤，到达深部组织，并且进行精确空间定位，因此探讨超声敏感元件.利用超声调控基因表达，对肝脏等深部组织疾病的基因治疗具有重要意义。<br>　　超声在医学上应用广泛，其生物学效应主要可分为热效应和非热效应。利用超声波热效应产生的热量激活HSP70启动子，使其下游基因表达，这是转基因时空表达研究较多的一个领域。但 HSP70启动子的激活温度较高，通常在43℃才有明显基因表达增强，会一定程度上造成周围组织损伤。近年来，超声的非热效应逐渐受到人们的关注。已有文献报道，低强度脉冲超声(Low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)照射能够影响基因表达和信号通路。超声既然能够激活信号通路，产生多种生物学效应，那么可以推论，存在某些特定的序列，能够对低剂量的安全超声应答。通过随机合成大量启动子序列，从中筛选，能够找出对安全剂量超声应答的序列。<br>　　肝脏作为重要的网状内皮系统，能够吞噬大量纳米、微米颗粒，成为基因输送的主要组织和基因治疗的理想器官。肝纤维化是肝脏的一种慢性疾病，由肝脏损伤，修复过度所引起。在受到炎症、损伤等刺激后，肝脏的星状细胞激活、胶原纤维分泌增多，细胞外基质大量沉积，若不及时纠正，持续性的纤维化会导致不可逆的肝硬化，最终还可能演变为肝癌，极大威胁人类健康。肝纤维化过程涉及多种细胞、细胞因子及信号通路的改变，其中巨噬细胞在此过程中扮演了重要角色，不同亚型的巨噬细胞对肝纤维化有不同的作用。因此，我们设想以肝纤维化为疾病模型，通过导入外源基因，改变巨噬细胞的分化状态，并通过控制外源基因的表达来调控巨噬细胞功能，从而控制肝纤维化进程。<br>　　据报道，CCL4诱导的肝纤维化模型中，miR155敲除小鼠与野生型小鼠相比，纤维化程度显著降低，且这种降低作用与巨噬细胞关系表型及功能密切。本研究拟在寻找超声敏感元件的基础上，利用超声照射及超声敏感元件，精确调控 miR155 inhibitor的释放，控制miR155的表达水平，从而调控单核巨噬细胞的分化，影响肝脏纤维化进程。本研究的主要研究方法及结果如下：<br>　　1、构建随机文库筛选超声敏感元件<br>　　我们通过构建随机文库进行正向筛选。我们通过酶切、连接、克隆等分子生物学方法构建含大量pWPI-20NminiCMV-PAC的随机文库，通过20N＋miniCMV诱导耐药基因表达，其中PAC是指Puromycin抗性基因，即嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因（puromycin N-acetyl-transferase gene, PAC）。我们利用嘌呤霉素共培养未转染的HeLa细胞，显微镜下观察细胞状态，确定筛选的最佳浓度后，将构建好的随机文库转染细胞，进行超声照射，观察细胞状态。筛选在嘌呤霉素中存活的细胞，提取基因组测序，对安全超声反应的敏感元件，为下一步基因治疗提供序列。<br>　　2、RNA测序分析超声照射对小鼠间充质干细胞基因表达的影响<br>　　低强度超声对骨质愈合的促进作用被广泛报道，已成为人们的共识。基于超声对骨折愈合的促进作用，以及骨髓间充质干细胞的多种分化潜能和多样的作用，我们选取小鼠骨髓间充质干细胞（ bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）为研究对象，通过全骨髓贴壁法提取并培养C57BL6小鼠原代BM-MSCs，对MSCs进行100 mw/cm2、15 min的超声照射，同时设置对照组，利用RNA测序技术分析超声照射后小鼠骨髓间充质干细胞基因表达的改变，并利用分析软件对测序结果进行统计分析，寻找可能对超声敏感的调控元件。<br>　　3、肝纤维化模型的建立及microRNA(miRNA)的肝脏递送<br>　　我们选取6周-8周龄的雄性C57BL6小鼠为实验动物建立肝纤维化模型，通过25 ml/kg的CCL4（3:7溶于橄榄油）腹腔注射，同时设置橄榄油注射组为对照，分别于造模后2周、4周、6周、8周取组织，行病理检查，观察造模情况。为了使microRNA能顺利到达肝脏，并进入巨噬细胞，我们也进行了 microRNA体内输送的研究。我们选取了三种不同的实验方法，包括壳聚糖包裹的 PLGA纳米粒、商品化的超声微泡Targesphere，以及商品化体内核酸转染试剂Engreen，利用带荧光的miRNA观察不同核酸递送系统的效果。结果表明，壳聚糖包裹的 PLGA纳米粒很难将核酸递送至小鼠体内；Targesphere联合超声微泡爆破能够在一定程度上将核酸输送至小鼠肝脏；Engreen对体内转染的效果最好。<br>　　4、基于超声敏感元件的miR155精确时空干预在肝纤维化中的应用<br>　　我们将筛选出的超声敏感元件与miR155 inhibitor连接，构建质粒，以此实现对miR155表达水平的调控，并将构建好的质粒转入CCL4造模的肝纤维化小鼠体内，利用超声照射，调控miR155 inhibitor的表达，探讨超声对miR155 inhibitor诱导释放的效果及对肝纤维化的缓解和治疗作用。具体方法为将miR155 inhibitor输送至CCL4造模的C57小鼠体内，分别设置CCL4注射组，CCL4注射＋miRNA inhibitor NC组， CCL4注射＋miRNA inhibitor NC＋LIPUS组，CCL4注射＋miR155 inhibitor组，CCL4注射＋miR155 inhibitor＋LIPUS组，观察各组小鼠纤维化严重程度，统计分析miR155 inhibitor对肝纤维化进程的影响，目前这部分实验仍在进行中。