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摘要背景：<br>　　骨肉瘤是青少年常见、长骨干骺端好发的、原发高度恶性骨肿瘤。尽管新辅助化疗加外科手术的标准治疗使得一年之内未发现转移病例的五年存活率提高至55％～70%，但众多学者认为目前骨肉瘤的生存率以及治疗措施已进入到一个相对稳定的停滞时期，因为仍有15%～20%的肢体骨肉瘤患者在诊断同时就已发生转移；另有30％左右的患者在确诊后一年内即发生转移；这些患者因对化疗药物敏感度不高或耐药而预后不良。因此研发新药物势在必行。<br>　　YM155是咪唑类小分子化合物，为生存素（survivin）的特异性抑制剂，可直接与肿瘤细胞survivin启动子结合，下调survivin表达，从而抑制其抗凋亡作用。研究发现，YM155可抑制慢性淋巴细胞白血病、前列腺癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌等多种肿瘤survivin表达，抑制其抗凋亡作用，促使肿瘤细胞凋亡的发生，从而抑制肿瘤生长。目前，YM155用于多种肿瘤的治疗已初步进入临床试验阶段。同时一些报道已证实YM155可促使细胞发生自噬依赖性凋亡，为肿瘤细胞凋亡研究及为药物研发提供了理论基础。<br>　　本研究所前期验证了survivin在骨肉瘤中较高表达，并与肿瘤的外科分期密切相关。同时应用RNA干涉载体可降低survivin表达，从而抑制骨肉瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡。<br>　　目的：通过研究YM155对高转移骨肉瘤细胞系F5M2增殖、克隆形成、侵袭、迁移、细胞周期、细胞凋亡相关生物学恶性行为的影响；研究YM155对F5M2凋亡的影响并探讨其相关机制；观察YM155作用下F5M2是否有自噬的发生并探讨其与凋亡的关系；探讨YM155作为骨肉瘤治疗药物应用于临床的可行性。<br>　　方法：<br>　　1．采用MTT法、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验、流式细胞术检测YM155对骨肉瘤细胞系F5M2生物学恶性行为的影响。并通过透射电镜观察YM155对细胞形态结构的影响。<br>　　2．qRT-PCR方法、Western-blot探讨YM155对骨肉瘤细胞凋亡的相关机制。<br>　　3．利用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3感染骨肉瘤细胞，并通过共聚焦显微镜观察YM155作用下细胞自噬的发生以及自噬流的形成，并通过MDC染色观察YM155处理后细胞自噬的发生。<br>　　4．通过流式细胞术检测无药对照组、自噬抑制剂3-MA+YM155处理组、YM155处理组各组细胞的凋亡率，探讨抑制自噬对细胞凋亡的影响。<br>　　结果：<br>　　1．采用不同浓度的YM155处理F5M2细胞，MTT法检测结果发现，除1nmo l/L组外，各浓度YM155组细胞增殖抑制率显著高于无药对照组，且呈剂量依赖性升高；平板克隆形成实验发现YM155浓度为15、30nmo l/L时细胞克隆形成数量较无药对照组显著降低，且呈剂量依赖性降低；与对照组相比，细胞划痕实验结果显示YM155浓度为15、30nmol/L时细胞迁移距离随着YM155浓度的升高而降低；Transwell细胞侵袭实验结果显示，YM155浓度为15、30nmol/L时细胞通过Transwell小室膜转移到下室的细胞数量较无药对照组显著降低，与YM155浓度负相关；流式细胞仪检测发现 YM155浓度为5、15、30nmo l/L时各周期肿瘤细胞比率较无药对照组并无明显差异；流式细胞术检测结果显示YM155浓度为15、30nmo l/L时细胞凋亡率较无药对照组显著升高。透射电镜观察到，与无药对照组相比，YM155处理组电镜下可观察到细胞生长状态很差，细胞周边凸起近乎消失，与转移能力下降有关；细胞表型发生变化，细胞空泡增多，线粒体膜通透性增加、肿胀、发白；细胞核内可观察到染色质边集现象，发生凋亡。<br>　　2．通过qRT-PCR和蛋白质免疫印迹法发现，与无药对照组相比，YM155浓度为15、30nmol/L时，可明显抑制F5M2细胞survivin mRNA和蛋白质的表达，同时发现激活的casepase-3表达明显增加。<br>　　3．自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3成功感染骨肉瘤细胞系F5M2，各组细胞通过共聚焦显微镜可以观察到自噬的发生，且YM155浓度为10nmo l/L时自噬体和自噬溶酶体的数量较无药对照组明显增加；各组细胞通过MDC染色可观察到自噬小体，且YM155浓度为10nmol/L时较无药对照组自噬小体数量明显增加。<br>　　4．流式细胞术检测发现自噬抑制剂3-MA+YM155处理组较YM155处理组细胞凋亡率下降。<br>　　结论：<br>　　1．YM155可抑制F5M2增殖、克隆形成、侵袭及迁移能力，YM155可诱导F5M2凋亡，但对细胞周期无明显影响，YM155对肿瘤细胞周期的作用可能具有组织学特异性。<br>　　2．YM155诱导细胞凋亡的机制与抑制F5M2的survivin表达，继而激活caspase信号通路有关。<br>　　3．YM155可诱导F5M2自噬的发生以及自噬流的形成，且抑制细胞自噬可抑制YM155作用下细胞凋亡的发生，其机制尚不清楚。<br>　　4．本研究为YM155应用于骨肉瘤治疗奠定了基础，其有望成为治疗骨肉瘤的新手段，但其有效性和安全性仍需进一步深入研究。