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摘要【研究背景与目的】肝癌是高发和高致死的恶性肿瘤，约50％的肝癌发病及死亡都发生在中国。随着中国人口结构日趋老龄化，肝癌的发病率和死亡率将会进一步增长。肝细胞肝癌（HCC）是肝癌最主要的疾病类型，占全部肝癌的70%-90%，如何有效的治疗HCC，成为我们防治肝癌的首要任务。<br>　　肝癌是一种典型的高代谢型癌症。自Otto Warburg于1924年发现了肿瘤代谢过程中特有的有氧糖酵解现象，从而奠定了肿瘤代谢理论的基础以来，癌症甚至被有些学者称为是一种代谢病。肿瘤在代谢重编程过程中，显著上调了糖酵解速率和谷氨酰胺的摄取，并产生大量中间产物用于生物合成，谷氨酰胺（Gln）及葡萄糖（Glc）成为了肿瘤能量的最主要的来源。2011年，Hanahan和Weinberg在肿瘤原有六大特征的基础上增加了四个新的特征，而能量代谢异常是其中最为重要的一条，肿瘤代谢相关研究也成为了研究热点。<br>　　内环境稳态是生理活动的基础，肿瘤的高糖酵解率使大量酸性产物堆积，导致肿瘤胞内pH（pHi）和胞外pH（pHe）发生显著下调，形成肿瘤局部酸性微环境（A-TME）。一方面，降低的 pHe可损伤正常细胞、降解基质、促进肿瘤侵袭转移，及获得免疫耐受、化疗抵抗；另一方面，肿瘤pHi的下降会自我损伤，需要极为高效、快速的抵抗酸胁迫（AR）从而保证代谢、增殖需求。有观点认为囊泡型ATP酶（V-ATPase）和Na+/H+交换体（NHE）起到主要作用，但不能很好解释肿瘤细胞对能量的迫切需求与持续供应离子泵用于更多消耗的矛盾；新的研究认为肾型谷氨酰胺酶（Gls1）能够促进宫颈癌及乳腺癌对抗酸胁迫，但仍缺乏足够的证据。结合谷氨酰胺对肿瘤的能量供应来看，显然这种又能提供氮源与碳源的能量物质如果能够进一步帮助肿瘤耐酸，就更为符合肿瘤乃至机体的生物特性。但是否肿瘤细胞确实如此，特别是肝癌这种具有显著代谢异质性的癌症如此，仍需大量研究加以阐述。本课题旨在通过Gls1介导肝癌耐酸相应的研究，试图寻找Gls1及Gln对肝癌代谢作用的新的认识。<br>　　【研究方法】<br>　　第一部分肝癌细胞的谷氨酰胺依赖<br>　　1、不同条件下肝癌细胞的谷氨酰胺及葡萄糖缺失耐受检测。选取5种肝癌细胞系，分别用不含谷氨酰胺与不含葡萄糖的培养基培养细胞3天，对比含有谷氨酰胺及葡萄糖培养条件下的细胞相对增殖；<br>　　2、肝癌细胞系的Gln浓度依赖检测。利用不同浓度的Gln培养肝癌细胞系4天，在不同时间点检测所选细胞系的增殖情况，从而了解Gln的浓度依赖情况；<br>　　3、Gln对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响。通过含有或不含有Gln的培养条件进行培养，分别利用利用Transwell实验和细胞迁移实验，检测并比对各个肝癌细胞系中，缺失 Gln对肝癌细胞系侵袭能力和迁移能力的影响。<br>　　第二部分 Gls1及Gls2的组织分布<br>　　1、Gls1及Gls2在不同肝脏疾病中的表达。选取肝细胞肝癌、胆管细胞癌、结节性肝硬化及肝腺瘤病人的组织标本，通过免疫组织化学检测，对比病灶与病灶远端组织中Gls1及Gls2的表达情况。<br>　　2、Gls1及Gls2的肝癌组织表达。选取9例肝癌病人的癌、癌旁、远端组织，通过免疫组织化学检测，对比癌灶、癌旁及远端组织 Gls1及 Gls2的表达；通过选取6对肝癌的癌与癌旁组织，通过Western blotting检测Gls1及Gls2的蛋白表达情况。<br>　　第三部分 Gls1通过介导Gln促进肝癌细胞获得耐酸能力<br>　　1、Glu及α-KG补救实验。选取HepG2细胞及Hep3B细胞系，通过分别补充Gln的下游分解产物Glu及α-KG，检测对所选细胞的增殖恢复情况；<br>　　2、Gln缺失的pHe检测。通过含有或不含有Gln情况下，培养所选细胞5天，检测pHe随时间增加的变化情况，以了解胞外酸性环境的产生情况；<br>　　3、缺失Gln、抑制Gls1对肝癌细胞系耐酸能力的影响检测。分别通过含有或不含有Gln下，检测HepG2细胞及Hep3B细胞增殖变化，以反应细胞耐酸能力的变化；通过si-Gls1及小分子化合物抑制剂抑制Gls1活性的方法，对比不抑制时HepG2细胞及Hep3B细胞增殖变化，以反应细胞耐酸能力的变化；<br>　　4、抑制剂补充实验及Gln补救实验。通过抑制剂补充实验，检测HepG2细胞及Hep3B细胞在含有Gln，不同pH情况下培养时的细胞增殖变化；利用Gln的补救实验，观察上述细胞在抑制了Gls1后，不同pH下的细胞增殖变化。<br>　　第四部分抑制Gls1可进一步抑制酸性微环境下肝癌细胞系恶性表型<br>　　1、抑制Gls1对肝癌细胞系pHe的影响。利用siRNA及小分子化合物抑制剂分别抑制HepG2细胞及Hep3B细胞的Gls1，培养5天，在不同时间点检测细胞pHe的变化情况；<br>　　2、去除Gln和抑制Gls1对不同pH下肝癌细胞系侵袭能力影响。分别通过含有或不含有Gln下培养细胞，利用Transwell实验检测HepG2细胞及Hep3B细胞在不同pH下侵袭能力变化；通过si-Gls1及小分子化合物抑制剂抑制Gls1活性的方法，利用Transwell实验对比不抑制时HepG2细胞及Hep3B细胞在不同pH条件下侵袭能力的变化；<br>　　3、去除Gln和抑制Gls1对不同pH下肝癌细胞系迁移能力影响。分别通过含有或不含有Gln下培养细胞，利用迁移实验检测HepG2细胞及Hep3B细胞在不同pH下迁移能力变化；通过si-Gls1及小分子化合物抑制剂抑制Gls1活性的方法，利用迁移实验对比不抑制时HepG2细胞及Hep3B细胞在不同pH条件下迁移能力的变化。<br>　　第五部分 Gls1小分子化合物抑制剂对小鼠肝癌的治疗作用<br>　　1、联合化学法诱导肝癌小鼠模型的建立及Gls1抑制剂干预。利用BALB/c小鼠，通过DEN+CCl4+Ethanol联合诱导方案构建肝癌模型；利用Gls1抑制剂C968及BPTES干预肝癌小鼠6周后，进行相关检测；<br>　　2、观察应用Gls1抑制剂后的相关指标变化。通过 HE染色观察对比对照组与各处置组肝脏与肺的病理变化，通过 Western blotting检测Gls1及Gls2在干预后的变化情况；通过测量一般指标及生化指标，观察并对比各组小鼠差异。<br>　　第六部分肝癌中Gls1的DNA甲基化水平变化。选取完全正常、肝癌与癌旁组织，利用MassARRAY定量分析Gls1的DNA甲基化水平差异。<br>　　【主要研究结果】<br>　　第一部分肝癌细胞的恶性生物学行为高度依赖谷氨酰胺。肝癌细胞对Gln及Glc均具有显著依赖；在4mM以上Gln进行培养则对细胞增殖再无明显差异；而缺失Gln培养则能抑制肝癌细胞的侵袭及迁移能力；<br>　　第二部分 Gls1及Gls2的组织分布规律。对比病灶于病灶旁组织，Gls1在肝癌与胆管癌中表达上调而在结节性肝硬化及肝腺瘤中无明显变化；并且，Gls在肝癌中特异性的表达上调，而 Gls2则无明显变化；<br>　　第三部分 Gls1通过介导谷氨酰胺分解代谢促进肝癌细胞获取耐酸能力。通过补充 Gln分解的下游产物 Glu和α-KG不能完全恢复肝癌细胞增殖能力；而含有Gln4mM培养时，能导致细胞外酸性环境形成；分别通过pH6.0及pH7.0培养HepG2及Hep3B细胞系，缺失Gln或抑制Gls1能够显著降低酸性环境下细胞增殖能力；pH6.0培养细胞时，含有Gln的情况下抑制Gls1能抑制细胞增殖，而抑制Gls1情况下补谷氨酰胺则不能恢复细胞增殖；<br>　　第四部分抑制Gls1可降低酸性微环境下肝癌细胞恶性行为。通过抑制Gls1能够阻止肝癌细胞的胞外酸性微环境形成；去除Gln或抑制Gls1，能够进一步降低pH6.0下细胞的侵袭和迁移能力；<br>　　第五部分 Gls1小分子抑制剂对联合化学诱导小鼠原位肝癌的治疗作用。Gls1干预肝癌小鼠6周后，可见干预组能有效降低肝癌病理分级，生存率显著高于未处理组，能显著缩小瘤体直径，抑制肺部转移，并部分改善肝功能。<br>　　第六部分临床患者肝癌组织中Gls1的DNA甲基化水平变化规律。肝癌癌灶组织内的Gls1甲基化水平较癌旁与完全正常肝组织显著降低，而癌旁与正常组织两者间无显著性差异。<br>　　【结论】肝癌在代谢过程中产生酸性微环境，肝癌特异性上调表达的Gls1通过分解Gln产生 Glu和 NH3，一方面为肝癌增殖提供能量和生物合成原料，一方面促进介导肝癌细胞获得耐酸能力；抑制Gls1能够有效抑制酸性环境下肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，是一种很有前景的治疗方向，而肝癌组织发生特异性的去甲基化，是Gls1在肝癌上调的机制之一。