Basigin-2参与小胶质细胞调控氧诱导视网膜病变新生血管的生成-论文-万方医学网

Basigin-2参与小胶质细胞调控氧诱导视网膜病变新生血管的生成

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摘要【研究背景】早产儿视网膜病变（ROP）是一种多发于早产儿和低体重婴儿的视网膜血管病变，是目前世界范围内的首要儿童致盲病因。高浓度氧疗阻断了早产儿尚未成熟的视网膜血管的正常发育进程，造成周边视网膜缺血缺氧，继而引发异常新生血管生成，导致视网膜出血、渗出及增殖。因此，缺氧诱发的异常血管增生是ROP病理发生的核心机制之一。视网膜新生血管的形成是机体应对缺氧环境的适应性反应，包括内皮细胞与多种细胞的交互作用，过程十分复杂，机制远未阐明。 　　小胶质细胞是定居中枢神经系统（CNS）的组织巨噬细胞，参与免疫调节、组织发育、自身稳定及创伤修复过程。近来大量研究选用发育期的小鼠视网膜作为研究血管生成的模型，结果证实，视网膜小胶质细胞是血管生成的早期驱动力量。视网膜小胶质细胞与血管紧密相邻的解剖空间关系强烈提示，小胶质细胞在血管生成中的重要作用，但是其内在机制尚不清楚。此外，小胶质细胞具有很强的移动性，能感知生理及病理刺激，传递微环境的信号，迅速应对局部的趋化信号，通过分泌细胞因子及神经营养因子作用于周围神经及血管成分，完成细胞间的沟通。因此，小胶质细胞在ROP病变中极有可能传递局部的缺氧信号，产生适应性反应，促进视网膜新生血管生成。 　　Basigin是一种高度糖基化的跨膜糖蛋白，因具有诱导基质金属蛋白酶（MMP）生成的能力被命名为MMP诱导因子，简称EMMPRIN，也被称为CD147。Basigin具有多重生物功能，如免疫反应、基质降解及细胞移行。该分子尤其在肿瘤局部的缺氧环境下促进新生血管生成，从而加强肿瘤的侵袭和转移。它不仅具备蛋白酶诱导作用，促进MMP的生成，也能增加肿瘤及内皮细胞的可溶性血管内皮生长因子（VEGF）及血管内皮生长因子受体（VEGFR）2的分泌。在卵巢癌患者，Basigin可通过可溶性或者以外泌体形式分泌到微环境中，促进肿瘤血管生成。此外，有研究显示Basigin在单核-巨噬细胞的表达上调，增加其炎性活性。 　　Basigin广泛参与缺氧条件下新生血管的生成，但在以缺氧为核心环节的ROP病变中，Basigin是否参与小胶质细胞与血管内皮细胞之间的交互作用还有待研究。 　　【研究目的】探讨小胶质细胞通过Basigin-2调控缺氧相关的视网膜新生血管生成的作用及其机制，为拓展ROP等缺血缺氧性视网膜新生血管疾病的治疗提供实验依据。 　　【研究方法】 　　一、体内实验：Basigin参与小胶质细胞促进氧诱导视网膜病变（OIR）新生血管形成 　　（1）动物模型：建立小鼠OIR模型。 　　（2）组织病理：制作冰冻切片和视网膜铺片，采用免疫组化及Basigin、IBA-1免疫双荧光染色，标记Basigin及小胶质细胞，观察两者在视网膜的表达及两者的共定位。 　　（3）Western blot检测：测定OIR模型P12和P17，神经视网膜低氧诱导因子（HIF-1α）和Basigin蛋白表达的变化。 　　二、体外实验：小胶质细胞表达Basigin，增强视网膜脉络膜微血管内皮细胞血管生成能力。 　　（1）细胞模型：应用小胶质细胞 BV2细胞系，物理缺氧模式； 　　（2）构建共培养体系：共培养BV2细胞及视网膜脉络膜血管内皮细胞（RF/6A），或应用BV2细胞条件培养基； 　　（3）Western blot检测：测定不同处理条件下，小胶质细胞HIF-1α、Basigin、IGF-1、AKT、P-AKT、ERK及P-ERK等蛋白的表达变化以及RF/6A细胞 VEGF和VEGFR-2的表达变化； 　　（4）实时定量-PCR（qRT-PCR）：检测BV2细胞在不同处理条件下表达的Basigin-1和Basigin-2及IGF-1变化，以及RF/6A细胞 VEGF和VEGFR-2的表达变化； 　　（5）细胞迁移实验：利用transwell小室测定RF/6A的迁移能力； 　　（6）管腔形成实验：Matrigel铺胶，Image Pro Plus软件测量管腔形成的长度； 　　（7）siRNA转染：采用脂质体包裹siRNA沉默小胶质细胞Basigin-2的基因表达； 　　（8）细胞因子测定：应用细胞因子芯片，筛选出小胶质细胞缺氧后上调，且在Basigin-2敲减后出现下调的促进血管生成的可溶性功能分子； 　　（9）药物干预：分别应用AKT抑制剂（LY294002）及 MEK抑制剂（PD98549）抑制AKT或 ERK激活，分析其对IGF-1生成的作用；外源性给予IGF-1蛋白或IGF-1抗体及 IGF受体拮抗剂，阻断或激活 IGF-1信号，观察对 RF/6A管腔形成的影响； 　　（10）统计学分析：应用统计学软件SPSS17.0版进行分析。多个样本组间均数的比较采用单因素方差分析，任意组间两两比较采用Student-Newmann-Keuls（SNK）检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 　　【研究结果】 　　一、体内实验：Basigin在OIR模型视网膜新生血管簇周围聚集的小胶质细胞内高表达。与正常对照组相比，OIR模型视网膜冰冻切片及视网膜铺片从不同角度均显示，视网膜新生血管簇有明显的 IBA-1阳性的小胶质细胞聚集，且小胶质细胞标志物IBA-1与Basigin在新生血管区域有显著的共表达。OIR组P17神经视网膜Basigin的蛋白水平组较正常对照组显著增加。 　　二、体外实验：缺氧环境下，小胶质细胞增加Basigin-2表达，促进血管内皮细胞血管生成能力及其分子机制。 　　1.缺氧增加小胶质细胞HIF-1α及Basigin-2的表达。小胶质细胞表达的 HIF-1α及 Basigin蛋白随着物理缺氧时间的延长而增加。Basigin的蛋白表达在缺氧12h及24h组均较对照组显著增加。qRT-PCR检测发现，缺氧后的小胶质细胞仅表达Basigin-2，且随缺氧时间延长而增加。 　　2.缺氧处理后的小胶质细胞促进血管内皮细胞的管腔形成。缺氧处理后的小胶质细胞与血管内皮细胞共培养或其条件培养基，均能促进血管内皮细胞的管腔形成。接种后6h，共培养组管腔形成的长度均值比对照组增加60.80％；条件培养基组均值比对照组增加52.40%。但共培养组与条件培养基组相比无明显差别，提示对管腔形成的促进作用不依赖于两种细胞的直接接触。 　　3.脂质体包裹siRNA成功沉默Basigin-2。使用qRT-PCR及 Western blot测定使用脂质体包裹的siRNA敲减Basigin后的干涉效果。siRNA Basigin317和458两种序列都能明显下调Basigin的核酸及蛋白表达，但使用两种序列联合敲减较单独敲减组的效果更佳。 　　4.阻断小胶质细胞Basigin-2表达抑制血管内皮细胞血管生成能力 　　干涉小胶质细胞Basigin-2表达后，共培养条件下血管内皮细胞的迁移及管腔形成功能被抑制。敲减后迁移细胞数减少65.93%；接种后6h，管腔形成长度减少68.27%。 　　5.阻断小胶质细胞的Basigin-2表达抑制促血管生成因子的生成。细胞因子芯片测定敲减小胶质细胞Basigin-2基因后血管生成因子的改变，筛选出IGFBP2，IGF-1，Pro-MMP9，VEGFR-1等4个因子在缺氧后上调；且在Basigin-2敲减后，出现下调。其中 IGF-1表达改变最为显著，在缺氧后上调至基础值的3.11倍，敲减后下调为1.33倍。应用qRT-PCR及 Western blot检测，BV2敲减Basigin-2后，IGF-1的转录水平下降；蛋白表达下降。 　　6. IGF-1促进内皮细胞的管腔形成。培养基中分别加入IGF-1中和抗体及外源性IGF-1，结合对BV2的Basigin-2敲减，评价IGF-1对管腔形成的影响。接种后6h，模拟敲减联合IGF-1中和抗体组管腔形成减少28.83%；Basigin-2敲减联合IGF-1可增加管腔形成60.32%。 　　7. Basigin-2调控IGF-1表达的通路分析。分别使用LY294002和PD98549阻断AKT或ERK通路，qRT-PCR检测BV2细胞不同处理组IGF-1的mRNA水平。Basigin-2敲减及AKT抑制剂能逆转缺氧后上调的IGF-1趋势。Western blot测定BV2细胞不同处理组HIF-1，Basigin，IGF-1， P-AKT，AKT，P-ERK及ERK水平。在蛋白水平，缺氧增加 IGF-1表达，AKT抑制剂及Basigin-2敲减可以抑制IGF-1的产生，而ERK抑制剂不能抑制IGF-1的表达。 　　8. IGF-1增强内皮细胞管腔形成能力的分子机制。使用IGF-1受体中和抗体阻断内皮细胞的IGF-1信号，RF/6A的管腔形成长度减少101.33%。RF/6A表达的 VEGF核酸和蛋白水平无明显改变；但VEGFR-2的转录下调，蛋白表达减少。 　　【结论】本研究首次报道了Basigin参与小胶质细胞对氧诱导的视网膜病变新生血管生成的调控作用，证实视网膜新生血管簇有明显的小胶质细胞聚集，且小胶质细胞Basigin表达水平显著增加。体外研究证实了缺氧后小胶质细胞表达Basigin-2对血管生成的正性调控作用，且该作用不依赖于细胞间的直接接触。继而以脂质体包裹siRNA为研究平台，重点观察沉默小胶质细胞Basigin-2表达后对于血管生成的影响，提出并初步揭示Basigin-2通过PI3K/AKT途径增加了促血管生成因子IGF-1的分泌，IGF-1上调内皮细胞VEGFR-2的生成，增强血管生成的内在分子机制。研究结果拓展了对小胶质细胞的认识，并且揭示了小胶质细胞表达Basigin-2作为递质，促进缺氧相关的视网膜新生血管生成的调控作用及机制，为拓展缺血缺氧性视网膜新生血管疾病的治疗提供了新的实验依据。