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摘要研究背景与目的：<br>　　肺癌是目前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)约占肺癌的80％-85%，肿瘤转移是肺癌患者死亡的最主要原因。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）是上皮来源的肿瘤细胞发生侵袭和转移的前提条件。<br>　　DAL-1（Differentially expressed in Adenocarcinoma of the Lung）是抑癌基因，可抑制肺癌细胞EMT的发生，HSPA5（Heat Shock Protein5）是癌基因，可促进肺癌细胞EMT的发生，HSPA5蛋白可以和DAL-1蛋白直接结合。二者在EMT发生中的作用究竟如何？目前尚无相关研究报道。本实验研究DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌中的表达关系，并探讨它们与EMT发生的关系。<br>　　研究方法：<br>　　一、DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌细胞中的表达关系<br>　　1、利用Western blot方法检测不同非小细胞肺癌细胞中DAL-1和HSPA5的蛋白表达水平。<br>　　2、利用免疫荧光和激光共聚焦扫描技术观察DAL-1蛋白和HSPA5蛋白在H460细胞中的共定位情况。<br>　　3、分别用过表达DAL-1的慢病毒（LV-DAL-1）和阴性对照病毒（LV-CON1）感染A549细胞，利用RTq-PCR和Western blot方法检测过表达DAL-1对HSPA5的mRNA和蛋白表达的影响。<br>　　4、分别用过表达HSPA5的慢病毒（LV-HSPA5）和阴性对照病毒（LV-CON2）感染A549/LV-DAL-1细胞，利用RTq-PCR和Western blot方法检测过表达HSPA5对DAL-1的mRNA和蛋白表达的影响。<br>　　二、DAL-1和HSPA5对非小细胞肺癌细胞EMT、增殖、侵袭和迁移的影响<br>　　1、实验分为两组：A549/LV-DAL-1（实验组）和 A549/LV-CON1（阴性对照组）。利用RTq-PCR和Western blot方法检测E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达水平;利用CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖能力；利用细胞划痕实验、Transwell侵袭和迁移实验检测细胞体外侵袭和迁移能力。<br>　　2、分别用干扰HSPA5表达的慢病毒（LV- HSPA5 RNAi）和阴性对照病毒（LV-CON3）感染A549细胞，分别命名为A549/LV- HSPA5 RNAi（实验组1）和A549/LV-CON3（阴性对照组1）。分别用过表达HSPA5的慢病毒（LV-HSPA5）和阴性对照病毒（LV-CON2）感染 A549/LV- HSPA5 RNAi细胞，分别命名为A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-HSPA5（实验组2）和A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-CON2（阴性对照组2），利用上述方法检测HSPA5对A549细胞EMT、增殖、侵袭和迁移的影响。<br>　　三、DAL-1是否通过HSPA5影响EMT、增殖、侵袭和迁移的研究<br>　　1、分别用过表达HSPA5的慢病毒（LV-HSPA5）和阴性对照病毒（LV-CON2）感染A549/LV-DAL-1细胞，分别命名为：A549/LV-DAL-1/LV-HSPA5（实验组1）和A549/LV-DAL-1/LV-CON2（阴性对照组1）；分别用干扰HSPA5表达的慢病毒（LV-HSPA5 RNAi3）和阴性对照病毒（LV-CON3）感染A549/LV-DAL-1细胞，分别命名为 A549/LV-DAL-1/LV-HSPA5 RNAi（实验组2）和A549/LV-DAL-1/LV-CON3（阴性对照组2）。利用上述方法检测 HSPA5对A549/LV-DAL-1细胞EMT、增殖、侵袭和迁移的影响。<br>　　四、DAL-1和HSPA5对非小细胞肺癌细胞PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路的影响<br>　　1、实验分为两组：A549/LV-DAL-1（实验组）和A549/LV-CON1（阴性对照组）。利用Western blot方法检测两组细胞内PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、p53、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。<br>　　2、实验分为四组：A549/LV-HSPA5 RNAi（实验组1）、A549/LV-CON3（对照组1）、A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-HSPA5（实验组2）和 A549/LV-HSPA5 RNAi/LV-CON2（对照组3），利用Western blot方法检测各组细胞内PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、p53、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。<br>　　五、DAL-1是否通过HSPA5影响PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路的研究<br>　　实验分为两组：A549/LV-DAL-1/LV-HSPA5（实验组）和A549/LV-DAL-1/LV-CON2（阴性对照组），利用Western blot方法检测细胞内PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、p53、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平。<br>　　研究结果：<br>　　一、DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌细胞中的表达情况<br>　　1、DAL-1蛋白在H520和H460细胞中高表达，在A549、SPCA-1、H1975和H1299细胞中低表达；HSPA5蛋白在非小细胞肺癌细胞中高表达。<br>　　2、DAL-1蛋白和HSPA5蛋白共定位，主要共定位在细胞浆中。<br>　　3、DAL-1可下调HSPA5的mRNA和蛋白表达（P＜0.05）；HSPA5可下调DAL-1的蛋白表达（P＜0.05），但对DAL-1的mRNA无明显影响(P＞0.05)。<br>　　二、DAL-1和HSPA5对非小细胞肺癌细胞的EMT、增殖、侵袭和迁移的影响<br>　　1、DAL-1可上调A549细胞的E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达（P＜0.05），下调N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达（P＜0.05），抑制细胞体外增殖、侵袭和迁移（P＜0.05）。<br>　　2、HSPA5可下调A549细胞的E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达（P＜0.05），上调N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达（P＜0.05），促进细胞体外增殖、侵袭和迁移（P＜0.05）。<br>　　三、DAL-1是否通过HSPA5影响非小细胞肺癌细胞的EMT、增殖、侵袭和迁移的研究<br>　　1、A549/LV-DAL-1细胞过表达HSPA5后，E-cadherin和β-catenin的mRNA和蛋白表达下调（P＜0.05）, N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达上调（P＜0.05），细胞体外增殖、侵袭和迁移能力明显增强（P＜0.05）。<br>　　2、A549/LV-DAL-1细胞干扰HSPA5表达后，E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达均上调（P＜0.05），细胞体外增殖、侵袭和迁移能力明显减弱（P＜0.05）。<br>　　四、DAL-1和HSPA5在非小细胞肺癌细胞中对PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路和EMT的影响<br>　　1、DAL-1下调A549细胞的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达（P＜0.05），上调p53、E-cadherin和β-catenin蛋白表达（P＜0.05）。<br>　　2、HSPA5上调A549细胞的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达（P＜0.05），下调p53、E-cadherin和β-catenin蛋白表达（P＜0.05）。<br>　　六、DAL-1在非小细胞肺癌细胞中是否通过HSPA5来影响PI3K/Akt/Mdm2/p53信号通路和EMT的研究<br>　　A549/LV-DAL-1细胞过表达HSPA5后，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mdm2、p-Mdm2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达均上调（P＜0.05）；p53、E-cadherin和β-catenin蛋白表达均下调（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　在非小细胞肺癌细胞中：<br>　　1、DAL-1蛋白和HSPA5蛋白共定位，主要共定位在细胞浆。<br>　　2、DAL-1可下调HSPA5的mRNA和蛋白表达。<br>　　3、DAL-1可能通过下调HSPA5表达抑制EMT、增殖、侵袭和迁移。<br>　　4、DAL-1可能通过下调HSPA5表达下调PI3K、AKT、Mdm2蛋白表达和磷酸化，上调p53蛋白表达，从而抑制EMT。