摘要背景和目的:<br> miR-335在卵巢癌中低表达,是卵巢癌复发的独立风险因素,且参与调控癌细胞的侵袭转移能力,但其低表达的分子机制尚不清楚。转录因子Sp1在卵巢癌中高表达,促进卵巢癌的增殖和转移。且Sp1可以通过调节DNA甲基转移酶的表达进而负向调节基因表达。本课题拟阐明Sp1是否通过抑制miR-335表达,促进肿瘤增殖和迁移。<br> 方法:<br> 1.构建靶向沉默Sp1的短发卡RNA(shRNA)质粒shSp1,转染A2780、SKOV3细胞构建低表达Sp1的卵巢癌细胞株,转染shNC的细胞为阴性对照。同时利用Sp1抑制剂光神霉素(Mithramycin A)处理A2780、SKOV3细胞抑制Sp1表达。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测两种方法下调Sp1的效率。<br> 2.qRT-PCR检测下调Sp1后miR-335表达变化。<br> 3.miR-335拮抗剂(miR-335 inhibitor)转染用于下调miR-335的表达。<br> 4.细胞分四组::shNC组、shSp1组、shSp1/inhibitor阴性对照组(shSp1+miR-335 inhibitor NC)和共转染组(shSp1+miR-335 inhibitor)。划痕实验和Transwell小室迁移实验检测细胞的迁移能力,EdU增殖实验检测细胞的增殖能力。<br> 5.构建含miR-335-启动子的双荧光素酶报告基因转染细胞,验证Sp1对miR-335转录活性的调控。<br> 6. A2780和SKOV3细胞系下调Sp1后,利用qRT-PCR实验检测三种甲基化转移酶(DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)的表达变化。<br> 结果:<br> 1.与shNC细胞相比,转染shSp1的A2780、SKOV3细胞中Sp1的mRNA表达水平分别下降49%(PA2780=0.011)和47%(PSKOV3=0.007);光神霉素处理后A2780和SKOV3细胞中Sp1 mRNA的表达下调均大于80%(PA2780<0.001, PSKOV3=0.006)。蛋白免疫印迹检测Sp1蛋白水平变化与PCR结果一致。<br> 2.与shNC细胞相比,转染shSp1的A2780、SKOV3细胞中miR-335表达水平分别上调了1.8倍(PA2780=0.042)和1.7倍(PSKOV3=0.021);利用光神霉素下调Sp1后A2780和SKOV3细胞中miR-335的表达分别上调3.3倍(PA2780=0.027)和1.3倍(PSKOV3=0.045)。<br> 3.与inhibitor NC组相比,miR-335 inhibitor转染shSp1-A2780和shSp1-SKOV3细胞后,qRT-PCR提示 miR-335的敲除效率均达80%以上(P<0.001)。<br> 4.与shNC细胞相比,划痕实验显示shSp1转染的A2780和SKOV3细胞迁移能力分别下降了51.8%(PA2780<0.001)和65%(PSKOV3<0.001);Transwell迁移细胞数分别降低了66.2%(PA2780=0.035)和65.3%(PSKOV3=0.03),而shSp1+miR-335 inhibitor细胞与shSp1+miR-335 inhibitor NC细胞相比迁移距离百分比分别提高了1.4倍(PA2780=0.005)和2.4倍(PSKOV3<0.001),迁移细胞数量分别提高了5.1倍(PA2780=0.002)和4.6倍(PSKOV3<0.02)。提示下调miR-335可以逆转下调Sp1所致的肿瘤细胞迁移抑制。<br> 5.在A2780和SKOV3组细胞中,shSp1细胞与shNC细胞相比增殖能力分别降低了51%(PA2780=0.001)和28%(PSKOV3=0.03);而shSp1+miR-335 inhibitor细胞和shSp1+miR-335 inhibitor NC细胞相比增殖能力无明显变化。<br> 6.荧光素酶报告实验显示,与溶剂对照组相比,光神霉素处理可以显著增强miR-335启动子的转录活性。<br> 7.光神霉素可以下调三种甲基化转移酶(DNMT1、DNMT3a和 DNMT3b)的mRNA的表达。<br> 结论:<br> 转录因子 Sp1能够通过抑制 miR-335的转录促进上皮性卵巢癌的迁移,而Sp1对miR-335的调控是否由启动子甲基化介导还有待进一步研究。
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