检索历史 清除

摘要多种不利环境因素包括干旱、高盐、极端温度等常常造成植物生长发育障碍，导致农作物减产。发掘抗逆相关基因并解析其作用机制将有助于阐明植物抵御非生物逆境胁迫信号网络通路，对改良植物尤其是农作物的抗逆特性和遗传育种具有重要意义。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）与小麦（Triticum aestivum）有较近的亲缘关系，随着其基因组测序工作的完成，二穗短柄草作为新兴的单子叶禾本科模式植物受到越来越多的关注。<br>　　在本研究中，我们以二穗短柄草为研究对象，在其基因组中克隆了8个（包括一个可变剪接）14-3-3基因家族成员并分析了该基因家族在不同组织器官中及不同非生物逆境胁迫及信号分子处理下的表达模式；利用酵母双杂交实验分析了二穗短柄草14-3-3蛋白家族与AREB/ABF转录因子家族成员的相互作用关系；对经前期分析得到的抗逆候选基因BdGF14d和BdGF14g进行蛋白亚细胞定位分析并通过在烟草（Nicotiana tabacum）中过表达BdGF14d基因和BdGF14g基因，研究了其抗逆功能并分别对其抗逆机制进行了分析。<br>　　本文的研究内容和主要研究结果如下：<br>　　1）利用生物信息学方法共鉴定了8个（包括一个可变剪接）二穗短柄草14-3-3基因家族成员，将其分别命名为BdGF14a、BdGF14b、BdGF14c1、BdGF14c2、BdGF14d、BdGF14e、BdGF14f和BdGF14g。氨基酸多序列比对分析结果表明二穗短柄草14-3-3蛋白家族成员在进化上具有高度保守的特性。通过实时荧光定量PCR的方法，分析了二穗短柄草14-3-3基因家族成员在不同组织器官中及不同非生物逆境胁迫和信号分子处理下的转录表达模式。实验结果表明，二穗短柄草14-3-3基因家族成员转录表达广泛分布在茎、叶、幼穗等组织器官中，但在抽穗期的二穗短柄草根中的转录表达水平相对较低；不同家族成员在响应不同的非生物逆境胁迫及信号分子处理时具有不同的表达模式。BdGF14d在NaCl处理中转录表达水平显著上调，其它Bd14-3-3基因则有不同程度的下调。而在PEG处理中，BdGF14e转录表达水平则显著上调，BdGF14f和BdGF14g在添加20％PEG60003h后显著上调。在H2O2处理的样本中，BdGF14b转录表达水平显著上调，而BdGF14c1和BdGF14d则下调表达。在ABA处理的样本中，BdGF14e和BdGF14f基因转录表达水平明显上调，而BdGF14b和BdGF14g在处理1h后转录表达水平迅速上调，12h后则呈现下调表达趋势。<br>　　2）通过农杆菌侵染烟草叶片下表皮的瞬时转化实验，检测了二穗短柄草14-3-3蛋白BdGF14d和BdGF14g的亚细胞定位情况，结果表明BdGF14d蛋白和BdGF14g蛋白在细胞核、细胞质、细胞膜中均有分布。<br>　　3）利用酵母双杂交技术，对二穗短柄草14-3-3蛋白家族与ABA信号通路相关的AREB/ABF转录因子家族成员的相互作用模式进行分析研究。结果表明，除了BdGF14c2蛋白具有自我激活功能之外，二穗短柄草14-3-3蛋白家族成员与AREB/ABF转录因子家族不同成员之间存在相互作用。其中，所有14-3-3蛋白均能与BdbZIP62蛋白相互作用，但均不与BdbZIP56-2和BdFDL36蛋白相互作用。BdGF14c1和BdGF14e蛋白均能与BdbZIP56-1、BdbZIP71、BdbZIP16、BdbZIP62、BdbZIP41和BdFDL2蛋白相互作用；BdGF14d蛋白只与BdbZIP71、BdbZIP62两个AREB/ABF转录因子相互作用；BdGF14a蛋白与BdbZIP56-1、BdbZIP16、BdbZIP62、BdbZIP41转录因子存在相互作用；BdGF14b蛋白与BdbZIP56-1、BdbZIP71、BdbZIP62转录因子存在相互作用；BdGF14f蛋白与BdbZIP71、BdbZIP16、BdbZIP62、BdFDL2、BdbZIP41转录因子存在相互作用；BdGF14g蛋白与BdbZIP16、BdbZIP62、BdbZIP41AREB/ABF转录因子存在相互作用。<br>　　4）通过农杆菌侵染的转基因方法，在烟草中过表达BdGF14d基因，获得转基因阳性株系，对其进行了抗盐功能鉴定并分析了其抗盐机制。BdGF14d过表达烟草在添加NaCl的MS固体培养基中的根长显著长于野生型对照植株；在营养土中用NaCl处理35天后，BdGF14d过表达烟草植株的生长状态显著优于野生型对照植株，其成活率显著高于野生型和空载体对照植株。测量盐胁迫处理后各转基因株系及野生型烟草叶片中抗氧化酶活力结果表明，BdGF14d基因过表达烟草株系的抗氧化酶活力显著高于野生型对照植株；叶片中的过氧化氢含量、相对电导率、丙二醛含量、钠离子水平显著低于野生型对照植株；ABA信号通路相关基因NtNCED1，NtABF2，TobLTP1转录表达水平、相关离子通道基因包括质膜Na+/H+反向转运载体基因NtSOS1、液泡膜Na+/H+反向转运载体基因NtNHX2，NtNHX4转录表达水平、相关抗氧化酶基因NtCAT，NtPOX2转录表达水平显著高于野生型对照植株；在ABA及NaCl处理下，BdGF14d过表达烟草植株的气孔关闭程度显著大于野生型对照植株。<br>　　5）通过农杆菌侵染的转基因方法，在烟草中过表达BdGF14g基因，筛选得到阳性转基因植株，对其进行抗旱功能鉴定并分析了其抗旱机制。BdGF14g过表达烟草株系在甘露醇处理的MS固体培养基中，根长显著长于野生型对照植株；在营养土中干旱处理25天后，BdGF14g过表达烟草株系的生长状态显著优于野生型对照植株；浇水恢复7天后，野生型及空载体对照烟草植株萎蔫、枯黄甚至死亡，而BdGF14g基因过表达烟草株系生长状态良好。存活率统计结果表明，转基因烟草株系存活率显著高于野生型及空载体对照。测量干旱处理15天后各转基因株系及野生型烟草叶片中抗氧化酶活力，发现BdGF14g基因过表达烟草株系的抗氧化酶活力显著高于野生型对照植株；叶片中的过氧化氢含量、离子渗漏、丙二醛含量显著低于野生型对照植株；相对水含量、内源ABA水平、ABA信号通路相关基因NtNCED1和NtABF2转录表达水平显著高于野生型对照植株；在ABA及脱水处理下，BdGF14g基因过表达烟草株系的气孔关闭程度显著大于野生型对照植株。在含有甘露醇的MS固体培养基中添加内源ABA合成抑制剂钨酸钠后，BdGF14g基因过表达烟草株系的抗氧化酶活力与野生型对照间并无明显差异。