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摘要植物在其生长过程中会遭遇病害、干旱、冷胁迫、盐胁迫等多种生物逆境胁迫和非生物逆境物胁迫，这些胁迫影响植物的生长发育，造成作物减产甚至绝收。植物在进化过程中形成了复杂的胁迫信号转导网络应对逆境胁迫。脱落酸（Abscisic acid，ABA）是植物响应逆境胁迫过程中的重要植物激素。近年来的研究已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中建立了ABA-PYL-PP2C-SnRK2信号通路调控模型。但是在二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中关于ABA受体PYL家族和A类PP2C亚家族的研究还尚未见报道。二穗短柄草作为一种新型单子叶模式植物，与小麦、水稻、玉米等禾谷类作物亲缘关系较近，对二穗短柄草的基因功能研究能为对这些作物的研究提供参考。本文研究了二穗短柄草A类PP2C在ABA信号通路中的调控作用及其在非生物逆境胁迫应答中的反应。首先分离了二穗短柄草PYL家族和A类PP2C亚家族成员，基于相互作用和转录表达分析结果，选定了A类PP2C亚家族的成员BdPP2CA6进行深入研究。利用遗传学手段、生化和分子生物学研究方法，探究了BdPP2CA6在非生物逆境胁迫中的功能和作用机制。主要研究结果如下：<br>　　1)二穗短柄草PYL家族和A类PP2C亚家族成员的鉴定和生物信息学分析<br>　　从二穗短柄草全基因组数据库中鉴定出12个BdPYL基因和86个BdPP2C基因，通过系统进化树分析分离出8个二穗短柄草A类PP2C基因BdPP2CA。序列比对分析发现，BdPYL和BdPP2CA各家族成员内部的结构域高度保守，对BdPYL和BdPP2CA基因启动子的顺式作用元件分析发现，BdPP2CA1、BdPP2CA6、BdPP2CA7和BdPP2CA8的启动子区域内含有很多与ABA有关的顺式作用元件，表明它们可能参与ABA信号通路。<br>　　2)BdPYL和BdPP2CA的相互作用分析<br>　　成功地克隆出12个BdPYL基因和7个BdPP2CA基因，并将它们分别构建到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中，以研究相互作用关系。发现只有BdPYL11能在没有外源ABA的条件下与BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6或BdPP2CA8相<br>　　互作用。通过双分子荧光互补实验，确认了BdPYL11与BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6或BdPP2CA8在植物体内的相互作用关系。同时只有BdPYL11与BdPP2CA6的复合体定位到细胞核，其余组合均定位到全细胞。因此，我们进一步研究了这五个基因。<br>　　3)转录表达分析和亚细胞定位分析<br>　　转录表达分析显示，在ABA、NaCl或PEG6000处理后，BdPYL11表达下调，而BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6、BdPP2CA8表达上调。基因枪轰击洋葱表皮细胞的研究表明，BdPYL11、BdPP2CA4、BdPP2CA5和BdPP2CA8定位在细胞核、细胞膜和细胞质，而BdPP2CA6则定位在细胞核。表明BdPP2CA6能将BdPYL11招募到细胞核发挥作用。因此，我们最终选择BdPP2CA6进行基因功能分析，并获得了BdPP2CA6过表达的转基因拟南芥。<br>　　4)BdPP2CA6转基因拟南芥对ABA超敏感<br>　　使用不同浓度ABA处理拟南芥幼苗发现，与野生型和转空载型拟南芥相比，BdPP2CA6转基因拟南芥幼苗对ABA更敏感，并且敏感程度随ABA浓度提高而升高。ABA瞬时处理拟南芥叶片发现，BdPP2CA6转基因拟南芥叶片的气孔在ABA的刺激下闭合速率更快，表明BdPP2CA6转基因拟南芥对ABA超敏感。<br>　　5)BdPP2CA6提高转基因拟南芥对盐胁迫耐受性<br>　　对拟南芥幼苗和成苗进行盐胁迫处理发现BdPP2CA6转基因拟南芥植株对盐胁迫的耐受性更高。同时使用NaCl瞬时处理拟南芥叶片发现，BdPP2CA6转基因拟南芥叶片的气孔在盐处理下闭合速率更快，表明BdPP2CA6提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。<br>　　6)BdPP2CA6转基因拟南芥对盐胁迫耐受性的生理分析和相关基因表达分析<br>　　研究发现BdPP2CA6能显著提高拟南芥体内K+/Na+比，并且是通过提高拟南芥体内K+的积累而不是Na+的积累实现的。对BdPP2CA6转基因拟南芥盐胁迫处理后生理指标的测定表明，BdPP2CA6转基因拟南芥的叶绿素和脯氨酸含量均高于野生型拟南芥植株，而丙二醛含量、双氧水含量和离子渗漏均低于野生型拟南芥。这些结果说明，BdPP2CA6转基因拟南芥在盐胁迫下受到更少的膜损伤和氧化损伤，因而对盐胁迫的耐受性更高。对与ABA信号通路和盐胁迫相关的基因或转录因子基因的表达模式研究表明，ABF2、ABF3、DREB2A、MYB15以及RD26受到盐胁迫后表达上调，并且它们在BdPP2CA6转基因拟南芥中的上调程度显著高于野生型拟南芥，说明BdPP2CA6通过上调一些与ABA信号通路和盐胁迫相关的基因或转录因子的表达，正调控植物响应盐胁迫信号通路。<br>　　7)BdPP2CA6与AtSnRK2和BdSnRK2之间的相互作用分析<br>　　为了研究BdPP2CA6在植物非生物胁迫应答中的分子机理，我们研究了BdPP2CA6与AtSnRK2和BdSnRK2之间的相互作用。结果表明BdPP2CA6与AtSnRK2.3之间有较强的相互作用，BdPP2CA6与BdSnRK2.2之间则只有较弱的相互作用，并且我们不能通过双分子荧光互补实验检测出这种较弱的相互作用。因此我们推测BdPP2CA6可能不是通过调节SnRK2来正调控植物对盐胁迫应答和植物体内ABA信号通路。<br>　　本研究分离并克隆了A类PP2C基因BdPP2CA6，BdPP2CA6蛋白可以和BdPYL11在没有外源ABA的条件下相互作用并定位在细胞核。过表达BdPP2CA6提高了拟南芥对ABA的敏感度和对盐胁迫的耐受性。我们的研究表明BdPP2CA6正调控转基因拟南芥的ABA信号通路和胁迫应答过程。