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摘要目的：Akt/PKB是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，处于多条信号通路的重要交叉点，调控细胞生长与存活、增殖与凋亡，糖类代谢、基因转录、新生血管形成、细胞迁移运动以及细胞周期调控等，体内许多疾病如肿瘤的发生发展均与它的异常激活密切相关。深入研究Akt有助于疾病发病机制的探讨和诊断治疗。RNAi是一种可高效、特异地下调目标基因的表达、并在基因功能研究和基因治疗领域有着广阔应用前景的技术。而构建目的基因的RNAi的有效表达载体则是实现这一目标的前提。为此，本研究构建针对人Akt基因的shRNA真核表达载体，分别在RNA水平和蛋白水平检测Akt在肿瘤细胞中的基因沉默情况。旨在为下一步深入研究Akt作用机制和构建慢病毒表达载体结合RNAi技术预防和治疗结肠癌、肝癌等恶性肿瘤提供实验基础。<br>　　方法：⑴Akt siRNA的设计合成及U6入门载体的构建。获取人Akt mRNA基因序列，设计合成2条针对Akt mRNA的特异性干扰序列（1＃shRNA、2＃shRNA），1条线虫的特定序列作为阴性对照序列（sh-NC）。将3条 ss oligo退火合成 ds oligo，克隆到入门载体pENTRTM／U6的黏性末端，构建出pENTRTM／U6-Akt shRNA入门载体（简称为 U6入门载体），转化入 TOP10大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素抗性平板筛选、挑取阳性克隆做菌落PCR初步鉴定，最后测序分析鉴定。⑵结肠癌、肝癌细胞的培养、转染和U6入门载体干扰效果的验证。通过换液、消化、传代、每5代液氮冻存等常规培养，培养生长稳定状态良好的肝癌和结肠癌细胞株。用脂质体Lipofectamine2000将测序正确的3个入门载体(分别标记为U6-1＃、U6-2＃，U6-NC)瞬时转染入细胞，分别在24h和48h提取总RNA和蛋白，RT-PCR检测Akt mRNA表达水平，western bolt检测Akt蛋白表达水平。观察分析Akt基因表达水平的变化差异。⑶pLenti6／BLOCK-iT-DEST目的表达载体的构建和干扰效果的验证。将构建成功的U6入门载体与目的表达载体进行 LR位点特异性重组（重组体为pLenti6／BLOCK-iT-Akt shRNA目的表达载体，分别标记为 pL-1＃、pL-2＃， pL-NC)），转化入Stb13大肠杆菌感受态细胞，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆，菌落 PCR初步鉴定后测定序列。同样，用脂质体转染将重组质粒导入肿瘤细胞，检测Akt基因的表达变化。<br>　　结果：①ds oligo退火完整性检测良好，Akt shRNA与U6载体顺利连接转化后，抗性筛选出若干阳性克隆，菌落 PCR扩增出相应分子量的条带。测序分析完全正确，成功构建出pENTRM TM/U6入门载体介导的表达Akt shRNA的质粒（pENTRM TM/U6-Akt shRNA）。②肝癌和结肠癌细胞株均生长稳定、状态良好。RT-PCR显示：在内参照GAPDH丰度基本相同的情况下，与NC（未转染阴性对照）相比，U6-1＃、U6-2＃条带明显较弱，且U6-1＃比U6-2＃更弱，干扰效果更好；转染后48h Akt蛋白表达量高于转染后24h蛋白表达量，内参基本相同情况下，U6-1＃、U6-2＃蛋白表达量比NC明显下调，且U6-1＃比U6-2＃下调更显著，与RT-PCR结果一致。③位点特异性重组后成功构建出携带靶基因干扰片段的pLenti6／BLOCK-iT-Akt shRNA目的表达载体，抗性筛选出阳性克隆，菌落PCR扩增出相应分子量条带，测定序列正确，RT-PCR检测，与NC和sh-NC（阴性对照序列）相比， pL-1＃、pL-2＃条带明显变弱，且前者下调Akt更显著。<br>　　结论：成功构建了Akt的U6入门和目的表达载体介导的Akt shRNA真核表达系统，为构建慢病毒表达载体，进一步研究 Akt的基因功能和生物学效应，探讨疾病作用机制奠定基础。在本实验应用的肝癌和结肠癌细胞株中，所设计 Akt1＃shRNA特异性干扰Akt基因和蛋白的表达，具有较好的基因沉默效果。