黄连碱体外抑制caspase-1剪切活性及其基于TLR-4炎症信号转导通路抗炎机制研究-论文-万方医学网

黄连碱体外抑制caspase-1剪切活性及其基于TLR-4炎症信号转导通路抗炎机制研究

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摘要目的： 　　三黄泻心汤作为经典方剂临床上常用于动脉粥样硬化，上呼吸道感染，糖尿病肾病，胃炎胃溃疡等疾病的治疗，化学成分研究显示其主要含有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分。课题组前期研究炎症通路级联放大效应探索了大黄-黄芩“相使为用”增效的分子机制，建立了LPS诱导小鼠腹膜巨噬细胞Raw264.7炎症模型，以对LPS介导产生NO的抑制作用为评价指标，对黄连5个主要单体成分进行了活性筛选，针对抑制活性最佳的黄连碱对该模型中NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎症信号通路的激活进行了深入研究。然而，研究未涉及三黄泻心汤成分对NLRP3炎症小体通路的影响。Caspase-1作为NLRP3炎症小体的重要组成部分之一，通过体外构建 caspase-1抑制剂筛选体系，再对三黄泻心汤主要单体成分进行目的性筛选，可为三黄泻心汤以及单体成分的临床使用提供理论依据。 　　方法： 　　（1）以caspase-1 cDNA为模板，分别以（BamH I-p20，p20-Sal I）、（BamH I-p10，p10-Sal I）以及（BamH I-p20，p10-Sal I）为上下游引物，进行PCR扩增后，使用限制性内切酶 SalI、BamHI分别消化扩增后的产物以及原核表达载体pColdI，采用 T4连接酶将目的片段与原核载体连接成重组质粒，转化如宿主细胞并进行复制，利用载体自身具备的抗Amp抗生素基因，筛出重组质粒； 　　（2）将构建好的重组质粒转入表达感受态细胞Trans BL21（DE3），利用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在原核表达系统中诱导外源基因的表达。pCold I载体携带冷应激基因cspA启动子，能够在低温条件下表达，通过抑制其他蛋白质的表达来提高目的蛋白的产量。 　　（3）亲和层析法纯化蛋白：pCold I载体携带6×His标签（His-tag），该标签能够与二价金属离子,如Ni2+、Co2+等螯合，通过亲和层析的方法对目标蛋白进行纯化。 　　（4）构建caspase-1体外活性筛选体系，对三黄泻心汤主要单体成分小檗碱（Ber）、黄连碱（Cop）、表小檗碱（Epi）、巴马汀（Pal）、药根碱（Jatr）、大黄酸（Rhe）、大黄素（Emo）、芦荟大黄素（Alo）、大黄酚（Chry）、大黄素甲醚（Phy）、黄芩苷（Bae）、黄芩素（Bai）、汉黄芩素（Wogi）以及汉黄芩苷（Woga）进行抑制活性筛选，终浓度50μM；以VX-765（100nM）为阳性对照； 　　（5）Raw264.7细胞接种于6孔板，密度达到80%换无血清培养基，黄连碱（1-30μM）作用2h后，LPS（1μg/mL）继续刺激24h，裂解细胞；SDS-PAGE上样检测，分别使用anti-TLR-4和anti-MyD88一抗检测各组蛋白表达； 　　（6）Raw264.7细胞接种于6孔板中过夜培养，以Cop（1-30μM）、Ber30μM预处理1h后加入Alexa Fluor488 conjugated LPS孵育20min。使用4%多聚甲醛固定20min，TLR-4一抗于4℃条件下孵育2h，Alexa Fluor545 conjugate二抗孵育1h，于激光共聚焦显微镜下观察。 　　（7）THP-1细胞接种于24孔板中，100nM PMA诱导24h贴壁。用不含血清培养基换液，（1-30μM）Cop预处理1h后，分别采用IFN-γ（1000U）以及IFN-γ（1000U）+LPS（1μg/ml）继续刺激24h后，收集培养基上清，用于NO水平的检测。 　　（8）SD大鼠脚底皮下注射角叉菜胶（carrageenan）建立足肿胀模型，使用足趾容积检测仪0-4h内检测黄连碱对carrageenan诱导的大鼠足肿胀以及体表温度升高的影响；收集大鼠肿胀部位皮下组织，冰面上匀浆，离心后得到匀浆液上清，采用Elisa法检测各组大鼠肿胀部位组织中细胞因子NO以及TNF-α的水平。 　　结果： 　　(1) PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，在1000bp左右能看见明显的特异性条带；p20、p10、p10(D381E)、p20p10以及p20p10(D381E)与pCold I双酶切后，连接酶分别连接过夜并转化进DH5α感受态细胞，挑取5个单克隆进行酶切鉴定以及菌落的PCR鉴定，结合测序结果表明所筛选的菌落为阳性克隆； 　　(2)考马斯亮蓝染色，结果表明IPTG诱导后， p20、p10以及p20p10蛋白大量表达，在25kDa、14.4kDa以及45kD左右有明显条带； 　　(3)亲和层析法纯化以上蛋白后，在包含Ac-WEHD-AMC的体系中不具有剪切活性；将上述蛋白纯化前的裂解液上清加入体系中，结果显示p20p10与p20p10（D381E）裂解液上清具备剪切活性； 　　(4)以上泻心汤单体成分中，Cop、Jatr以及Emodin对caspase-1的活性抑制率大于60%。 　　Cop抑制效果最佳，IC50=31.66±0.22μM； 　　(5) LPS诱导RAW264.7细胞TLR-4以及MyD88蛋白表达升高，（1-30μM）黄连碱对其无明显抑制作用； 　　(6)黄连碱1-30μM对LPS和TLR-4的绑定无明显作用，而小檗碱30μM，与报道相符，可显著抑制该绑定； 　　(7) IFN-γ（1000U）以及 IFN-γ（1000U）+LPS（1μg/ml）均可刺激 THP-1细胞释放NO，高剂量Cop对其有一定的抑制作用。 　　(8)皮下注射角叉菜胶引起大鼠足肿胀以及肿胀部位体表温度升高，黄连碱3.87mg/kg显著抑制大鼠足肿胀程度，同时显著减少肿胀部位组织匀浆中NO和TNF-α的产量。 　　结论： 　　(1)三黄泻心汤主要单体成分均对caspase-1剪切活性有不同程度的抑制作用，其中黄连碱的抑制作用最强； 　　(2)黄连碱对LPS诱导的Raw264.7细胞TLR-4和MyD88蛋白高表达无明显抑制作用，对TLR-4与LPS绑定无影响； 　　(3)黄连碱抑制IFN-γ以及IFN-γ+LPS诱导的THP-1细胞NO释放； 　　(4)黄连碱对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀有明显改善作用。