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摘要衰老是植物生命的最后一个阶段，是植物适应外界环境、进化选择的结果。叶片是植物光合作用的主要场所，因此叶片衰老对于植物衰老具有非常重要的意义。棉花作为天然纤维的主要来源，为我国的纺织工业提供了大量的原材料。短季棉能够有效地缓解麦-棉争地的矛盾，但早熟往往伴随着早衰，而早衰严重影响棉纤维的产量和品质。NAC(NAM, ATAF1/ATAF2, CUC1)转录因子是植物特有的、较大的转录因子家族之一，它在调控植物生长发育过程的同时，参与植物对生物胁迫与非生物胁迫的响应。多项研究表明 NAC转录因子在不同植物的叶片自然衰老和胁迫衰老中发挥着关键的调控作用。棉花三个基因组(D、A和AD)数据测序的完成，丰富了基因组水平NAC转录因子的相关分析，但是棉花中关于 NAC单基因功能的研究相对较少。本研究主要阐述了陆地棉中GhNAC63和GhNAC79基因的功能，并对这2个基因相关的GT转录因子进行了相关分析。研究具体有以下几个方面：<br>　　1、陆地棉中GhNAC63转录因子的克隆及功能鉴定<br>　　在陆地棉中同源克隆得到JUB1的同源基因GhNAC63，利用基因组数据，克隆得到该基因的启动子序列；利用qRT-PCR，检测GhNAC63在不同组织、不同衰老特性短季棉品种子叶衰老过程中的表达模式、以及在不同培养条件下，对不同非生物胁迫的响应；通过XbaI和SacI酶切位点，构建35S-GhNAC63表达载体转入拟南芥，在纯合的T4世代进行表型观察；根据 pYL156-pYL192病毒体系诱导的基因沉默原理，降低棉花中GhNAC63的表达水平，观察棉株的表型。序列分析可知：GhNAC63包含保守的 NAM结构域，定位于scaffold246.1上，其启动子不仅包含基础顺式元件，同时包含涉及植物生长发育和胁迫相关的元件；基因表达模式分析可知：GhNAC63在纤维发育0DPA时优势表达，在花和茎中的表达水平相对较高，在根和纤维发育后期的表达水平较低，同时GhNAC63对乙烯处理敏感；转基因植物表型鉴定可知：35S-GhNAC63转基因拟南芥对干旱和乙烯胁迫的抗性降低，35S-GhNAC63转基因棉花的茎匍匐缠绕生长，不能形成花器官，相反地，降低棉花中GhNAC63的表达水平可使幼苗弥补VIGS注射造成的损伤，茁壮成长。本研究结果表明GhNAC63基因负调控植物生长发育，同时可能参与乙烯和干旱调控通路，丰富了 NAC转录因子在陆地棉中的功能研究，为后续该基因的研究奠定了基础和方向。<br>　　2、GhNAC79基因在植物开花及抗旱中的作用<br>　　根据陆地棉叶片衰老的RNA-seq数据库和基因组数据库，克隆得到GhNAC79基因及其启动子序列；根据GhNAC79的保守结构域特点，将其ORF划分为4部分，分别构建到pGBKT7载体中，转入酵母Y2H中验证GhNAC79的转录激活活性；构建启动子表达载体pGhNAC79-GUS，转入拟南芥，T0代转基因拟南芥经过GUS染色后，在体视显微镜下观察染色结果；利用qRT-PCR，探索GhNAC79的组织表达特异性、在子叶发育过程中的表达模式、以及对外界不同刺激的响应；构建35S-GhNAC79过表达载体，转入拟南芥和棉花，进一步对转基因植株进行表型观察；根据 pYL156-pYL192和pCLCrVA-pCLCrVB两种病毒体系介导的基因沉默原理，抑制GhNAC79在棉花中的表达，观察侵染后棉花的表型；利用酵母单杂交技术，挖掘GhNAC79上游调控因子。结果表明：GhNAC79定位于染色体骨架scaffold42.1上，包含3个外显子，2个内含子，同时GhNAC79因子具有转录激活活性，活性域位于C端。GhNAC79的启动子上除包含基础顺式元件外，同时包含多种胁迫响应相关的元件；GhNAC79在早衰品种中棉所10号的子叶衰老后期大量表达，其启动子在转基因拟南芥的子叶中特异表达；干旱能够显著性诱导 GhNAC79基因在叶片中的表达，而 GhNAC79过表达能够提高拟南芥和棉花对干旱的抗性，相反地，降低棉花中GhNAC79的表达水平，导致棉花对干旱的抗性降低。同时在干旱胁迫处理后，GhNAC79过表达转基因拟南芥和棉花的气孔开度显著性小于对照，气孔数目无明显差异，说明GhNAC79通过调节气孔开度调控植物对干旱的抗性。酵母单杂交的结果表明 GhNAC79基因的上游存在干旱响应因子，进一步证明GhNAC79参与干旱调控通路。本研究证明GhNAC79基因在植物干旱胁迫通路中发挥正调控作用，为棉花抗旱育种奠定分子基础，并提供转基因抗旱材料。<br>　　3、陆地棉GhGTs转录因子的克隆和表达分析<br>　　根据GhNAC63和GhNAC79的启动子分析结果可知，GhNAC63和GhNAC79的启动子上均包含GT光响应元件，GT转录因子能够结合到GT元件上，进而对光合作用进行调控。本研究基于棉花的3个基因组数据库对GT转录因子家族进行了基因组水平的分析。根据拟南芥和水稻中的GT转录因子，依赖于棉花3个mRNA数据库，通过同源检索得到67个GT转录因子，其中包含39个GhGTs(陆地棉)，14个GaGTs(亚洲棉)和14个GrGTs(雷蒙德氏棉)，对这67个GT转录因子进行染色体定位、聚类分析以及模体分析；根据陆地棉的39个GhGTs序列，从陆地棉衰老叶片中克隆得到8个GhGTs基因。利用qRT-PCR，分析这8个GhGTs基因在棉花根、茎、子叶、真叶、花和纤维中的表达模式，在不同非生物胁迫处理后的表达情况，在子叶和真叶发育过程中的表达模式；最后，筛选得到GhGT31基因，构建35S-GhGT31表达载体，转入拟南芥，并在纯合世代对转基因拟南芥进行表型鉴定，进一步分析GhGT31基因在植物中的功能。聚类和进化分析结果表明：GT转录因子在随着陆地棉的进化过程中变异较小，为纯化选择过程，39个GhGTs基因均匀地分布于不同亚类中，且同一亚类中水稻及拟南芥的GTs成员涉及不同的信号通路，说明GhGTs作用的广泛性，同时相同亚类中的GhGTs基因包含相似的模体结构；8个衰老相关基因的表达模式分析结果表明：8个GhGTs基因在子叶和真叶衰老过程中、以及在不同胁迫处理后，表现出不同的表达模式。除GhGT20外，其余7个GhGTs基因在根中优势表达，同时8个GhGTs基因在纤维发育后期的表达水平较高。GhGT12对ABA、乙烯和茉莉酸甲酯均敏感，并在中棉所10号子叶衰老后期上调表达，说明GhGT12可能是涉及激素介导的叶片衰老通路中的一个重要因子。GhGT31在早衰品种中棉所10号的子叶衰老后期高水平表达，同时对干旱处理敏感，35S-GhGT31转基因拟南芥提前抽薹，说明GhGT31可能参与了干旱相关的叶片衰老调控通路。本研究初步分析了陆地棉中GhGTs基因的功能，为后续研究棉花中的GT转录因子打下分子基础。