检索历史 清除

摘要脂肪生成过程中受到众多转录因子调控，过去二三十年大量研究证实，虽有大量转录因子被鉴定出来参与脂肪的发育调控，但机制仍不清晰。课题组前期在SV细胞诱导成脂分化过程中，利用RNA-seq和生物信息学分析，筛选出一个新的转录因子Zfp217可能参与调控脂肪生成。因此，本文以3T3-L1前脂肪细胞为研究材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Zfp217基因敲除单克隆细胞系，探讨Zfp217对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响；此外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Zfp217基因敲除小鼠，进一步验证Zfp217与脂肪形成的关系。<br>　　本研究主要内容包括：⑴筛选有剪切活性的sgRNA。首先利用sgRNAcas9_3.0.5软件和http://crispr.mit.edu/网站针对Zfp217基因第一外显子设计4个sgRNA，成功构建了CRISPR/Cas9系统（pX458）载体，利用T7E1酶切和DNA测序等方法初步鉴定出sgRNA-2、sgRNA-3及sgRNA-4有剪切活性。⑵构建Zfp217基因敲除单克隆细胞系，研究Zfp217对3T3-L1细胞成脂分化的影响。将含有sgRNA-4的pX458载体转染3T3-L1细胞，获得了纯合敲除Zfp217单克隆细胞系。采用油红 O染色，观察 Zfp217基因敲除单克隆细胞系，发现纯合Zfp217基因敲除细胞系比对照组细胞的脂滴数量明显减少；Western Blot分析脂肪标志基因表达发现，敲除Zfp217明显抑制脂肪标志基因PPARγ和aP2蛋白表达。以上结果表明，敲除Zfp217能够抑制3T3-L1细胞的成脂分化。⑶制备Zfp217基因敲除小鼠。首先PCR扩增sgRNA-2和sgRNA-4体外转录模板，利用体外转录试剂盒将其进行体外转录及纯化，运用原核显微注射方式将sgRNA-2、sgRNA-4及Cas9 mRNA混合注射到小鼠受精卵并发育成囊胚，然后将其胚胎移植到假孕母鼠子宫内，21 d后共获得15只小鼠。⑷Zfp217基因敲除阳性小鼠的鉴定。F0代小鼠中，利用PCR基因分型和DNA测序方法获得10只阳性敲除的小鼠，结果表明Zfp217基因敲除小鼠构建成功。