检索历史 清除

摘要背景：程序性细胞死亡对于多细胞生物体的生长发育和稳态维持起着至关重要的作用。长期以来，细胞凋亡被认为是生理情况下主要的程序性死亡方式，而坏死易发生在意外的机械等损伤中。近年来，RIP3依赖的坏死（程序性坏死）被证明是一种受到调控的坏死形式，并且程序性坏死与一些重要疾病诸如缺血引起的急性肾损伤、缺血性心脑血管疾病、神经退行性疾病和动脉粥样硬化等有关。因此，研发有效的程序性坏死抑制剂将为相关疾病的治疗提供新策略。<br>　　目的：旨在运用高通量筛选方案发现小分子程序性坏死抑制剂，综合运用分子生物学、化学生物学、细胞生物学等研究方法阐明其对程序性坏死的抑制机理，并探索将其运用于坏死相关疾病的治疗潜能。<br>　　方法：为了筛选抑制TNF-α诱导的程序性坏死的小分子，我们利用小分子化合物文库中的化合物预处理培养的HT-29细胞，用TNF-α、Smac mimetic和Z-VAD协同诱导细胞程序性坏死，通过检测细胞存活率从而鉴定程序性坏死抑制剂；为了提高坏死抑制剂的效能，我们通过化学修饰和结构活性关系分析获得一系列抑制程序性坏死的类似物，并得到一个极为强效的小分子；为了探究小分子化合物对程序性坏死的抑制机理，我们通过蛋白质免疫印迹检测RIP3和MLKL的磷酸化，通过免疫荧光检测RIP1和RIP3形成的点状聚集物；并结合它对TNF-α以外的多条程序性坏死信号通路包括Toll样受体介导的，HSV-1病毒诱导的程序性坏死的抑制效果，推测其作用靶点可能是RIP1或RIP3激酶；通过体外激酶活性实验发现PK68特异性选择抑制RIP1蛋白激酶活性；利用不依赖于RIP1激酶活性的程序性坏死类型，排除PK68的脱靶效应；通过组织HE染色，判断一定剂量的PK68持续给药对动物体内各器官的影响；在TNF-α诱导的系统性炎症反应综合征和缺血再灌注引起的肾损伤动物模型中检测PK68对疾病的缓解效果，以发掘PK68在人类坏死相关疾病中的应用潜能。<br>　　结果：<br>　　（1）发现PK6抑制TNF-α诱导的程序性坏死；（2）通过化学修饰得到一系列PK6结构类似物均具有抑制程序性坏死的能力，其中以PK68最为强效；（3）PK68抑制RIP3和MLKL磷酸化；（4）PK68阻止RIP3形成点状聚集；（5）PK68抑制Toll样受体介导的程序性坏死；（6）PK68抑制HSV-1诱导的程序性坏死；（7）PK68靶向RIP1激酶活性；（8）PK68不能抑制RIP3寡聚化或者MLKL寡聚化诱导的程序性坏死；（9）PK68不影响TNF-α诱导的NF-κB活化；（10）PK68对小鼠体内各组织器官并无毒性作用；（11）PK68保护小鼠免于TNF-α诱导系统性炎症反应综合征引起的死亡；（12）PK68缓解小鼠肾缺血再灌注引起的肾脏损伤。<br>　　结论：综上所述，我们的工作中发现了一个强效程序性坏死抑制剂PK68，其通过特异性抑制RIP1蛋白激酶活性从而阻止程序性坏死发生。PK68能够显著抑制TNF-α诱导小鼠系统性炎症反应综合征和肾缺血再灌注引起的肾损伤，因此，我们的发现对于探索坏死相关人类疾病及药物研发均有重要的指导意义。