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摘要目的：研究RMP（RPB5-mediating Protein）在TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）诱导的肝癌细胞凋亡中的作用及其分子机制。<br>　　方法：<br>　　1、用100ng/ml的 TRAIL分别处理人肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MDA-MB-231及人正常肝细胞7701、人肾上皮细胞293t，48h后，用流式细胞术检测对照组及实验组细胞凋亡率。<br>　　2、将RMP过表达（pCDNA3.1-RMPo）和RMP干扰（pGPU6-RMPi）慢病毒感染人肝癌细胞HepG2，48h-72h后用500ng/ml的puromycin筛选，得到RMP过表达和干扰的HepG2稳定细胞株，通过荧光定量PCR、Western blot技术进行鉴定。<br>　　3、使用100ng/ml的TRAIL分别处理HepG2空载体细胞（Vector）及RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株，24h后，使用流式细胞术检测对照组及实验组细胞凋亡率。<br>　　4、使用不同浓度（0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml）的TRAIL处理HepG2空载体（Vector）、RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株6h，用CCK8检测不同浓度的TRAIL对其产生的毒性作用。<br>　　5、使用100ng/ml的TRAIL分别处理HepG2空载体细胞（Vector）及RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株，8h后，使用Western blot技术检测对照组及实验组细胞中p-Bad、pro-Caspase3、cleaved Caspase3的蛋白表达量。<br>　　6、使用100ng/ml的TRAIL分别处理HepG2空载体细胞（Vector）及RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株3h，荧光定量PCR检测对照组及实验组细胞中Caspase8及DR4的mRNA相对表达量。<br>　　7、使用100ng/ml的TRAIL分别处理HepG2空载体（Vector）及RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株3h，荧光定量PCR检测对照组及实验组细胞中p53的mRNA相对表达量。<br>　　8、使用100ng/ml的TRAIL分别处理HepG2空载体细胞（Vector）、RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株8h，Western blot检测细胞中p53的蛋白表达量。<br>　　9、野生型HepG2细胞瞬时转染不同剂量（0μg、1μg、1.5μg、2μg）的RMP过表达（pCDNA3.1-RMPo）和干扰质粒（pGPU6-RMPi）后，Western blot技术检测p53的蛋白表达量。<br>　　10、在野生型HepG2细胞中，瞬时共同转染RMP过表达（pCDNA3.1-RMPo）质粒和p53过表达（pCDNA3.1-p53o）质粒，并使用100ng/ml的TRAIL处理，24h后，流式细胞术检测对照组及实验组的细胞凋亡率。<br>　　11、将p53启动子插入pGL3-basic载体多克隆位点处，成功构建p53启动子质粒pGL3-basic-p53 promoter。通过多功能酶标仪测定荧光活性，检测RMP与p53启动子的相互作用。<br>　　结果：<br>　　1、使用TRAIL分别处理野生型HepG2和7701细胞48 h，用流式细胞术检测细胞凋亡率显示，TRAIL可以成功诱导人肝癌细胞HepG2、乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡，对人肝正常细胞7701、人肾上皮细胞293t无毒害作用，同时也显示HepG2细胞对TRAIL有药物耐受作用。<br>　　2、经荧光定量PCR及Western blot鉴定，RMP过表达（pCDNA3.1-RMPo）和RMP干扰（pGPU6-RMPi）病毒成功感染人肝癌细胞HepG2，成功建立RMP稳定过表达（RMPo）和RMP稳定干扰（RMPi）细胞株及HepG2空载体（Vector）细胞株。<br>　　3、HepG2空载体（Vector）、RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株经100ng/ml的TRAIL处理24h后，流式细胞术检测凋亡结果显示，各细胞株均有不同程度的凋亡，RMPo稳定细胞株的细胞凋亡率低于Vector的细胞凋亡率，RMPi稳定细胞株凋亡率显著高于Vector，对TRAIL有较高敏感性。<br>　　4、HepG2空载体细胞（Vector）、RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株细胞经不同浓度（0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml）的TRAIL处理6h后发现，TRAIL对细胞的毒性作用随着TRAIL浓度的升高而增高，而较对照组Vector，RMPo细胞株表现出显著的抑制TRAIL毒性的作用<br>　　5、HepG2空载体细胞（Vector）、RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株经100ng/ml的TRAIL处理8h后，Western blot结果显示，过表达RMP可以上调p-Bad蛋白水平的表达、抑制pro-Caspase3的蛋白水平的表达、降低Caspase3的活性。<br>　　6、HepG2空载体细胞（Vector）、RMP稳定过表达（RMPo）和稳定干扰（RMPi）细胞株经100ng/ml的TRAIL处理3h后，荧光定量PCR及Western blot结果显示，RMP可以在转录和翻译水平抑制Caspase8及DR4的表达。<br>　　7、HepG2空载体细胞（Vector）及RMPo、RMPi的稳定细胞株经100ng/ml的TRAIL处理10h后，荧光定量PCR及Western blot结果表明，RMP在转录和翻译水平均可以抑制p53的表达，而p53的表达量却不会随TRAIL的处理而升高。<br>　　8、野生型HepG2细胞瞬时转染不同剂量的RMP过表达和干扰质粒后，Western blot结果显示，RMP的蛋白表达量与p53蛋白表达量存在剂量效应，随着RMP表达的提高，p53的蛋白表达水平逐渐降低；随着RMP表达的降低，p53的蛋白表达水平逐渐升高。<br>　　9、在野生型HepG2细胞中，瞬时共同转染RMP过表达（pCDNA3.1-RMPo）质粒和p53过表达（pCDNA3.1-p53o）质粒，并使用100ng/ml的TRAIL处理24 h后，流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示，在RMPo细胞株中恢复p53的表达后凋亡率明显增高。<br>　　10、双荧光素酶报告基因检测结果发现，RMP不作用于p53启动子。<br>　　结论：<br>　　1、RMP可以抑制TRAIL介导的肝癌细胞的凋亡，使肝癌细胞对TRAIL具有耐受性。<br>　　2、RMP通过抑制p-Bad抑制Caspase3的活性，从而抑制TRAIL介导的凋亡。<br>　　3、RMP抑制p53 mRNA及蛋白水平的表达。<br>　　4、RMP抑制p53的下游DR4及Caspase8，从而抑制TRAIL介导的凋亡。<br>　　5、RMP不作用于p53启动子。