β3GnT8及其催化合成的多聚乳糖胺结构在肝癌恶性生物学表型中的作用研究-论文-万方医学网

β3GnT8及其催化合成的多聚乳糖胺结构在肝癌恶性生物学表型中的作用研究

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摘要第一部分、β3GnT8及其相关基因，多聚乳糖胺在肝癌中的差异表达分析 　　目的：分析在肝癌细胞和肝癌组织中，β3GnT8及其相关基因，多聚乳糖胺的差异性表达。 　　方法： 　　（1）qPCR检测人正常肝脏细胞株Lo2和QSG7701，人肝癌细胞株SMMC7721、SK-HEP-1和 HepG2中β3GnT1～β3GnT8基因，O-糖基化起始酶ppGalNAcT1和ppGalNAcT2，GlcNAcβ1,6分支N-糖链关键酶GnTV的mRNA表达水平； 　　（2）western blot检测人肝癌细胞株SMMC7721、SK-HEP-1和HepG2中β3GnT8蛋白表达； 　　（3）qPCR检测临床病人肝癌组织和癌旁组织样本中β3GnT2、β3GnT8、GnTV和c-jun的mRNA表达； 　　（4）免疫组织化学检测人肝癌组织和癌旁组织中β3GnT8、GnTV和c-jun的蛋白表达以及多聚乳糖胺结构表达水平。 　　结果： 　　（1）肝癌细胞株β3GnT8的表达水平高于正常细胞；β3GnT2与β3GnT8的表达趋势未见关联性；c-jun、GnTV的表达与β3GnT8在肝癌细胞株中的表达趋势基本一致； 　　（2）肝癌组织中β3GnT8表达水平高于癌旁组织，GnTV、c-Jun和多聚乳糖胺表达趋势与β3GnT8表达趋势一致。 　　结论：肝癌细胞中β3GnT8及其相关基因的差异化表达，提示可以利用几株肝癌细胞进行β3GnT8的功能研究，肝癌中c-jun和β3GnT8表达的一致性可初步推测在肝癌中β3GnT8可能受到c-jun的转录调控。 　　第二部分、β3GnT8表达对肝细胞癌恶性生物学表型及其糖基化的影响 　　目的：通过改变β3GnT8表达研究该基因对肝癌恶性生物学表型的影响，并对其控制合成的多聚乳糖胺结构、CD147蛋白糖基化和肝癌细胞糖链结构进行分析。 　　方法： 　　（1）慢病毒构建SK-Hep-1和SMMC7721细胞β3GnT8过表达细胞株； 　　（2）利用β3GnT8 RNA干扰载体下调HepG2、SK-Hep-1和SMMC7721中β3GnT8的表达； 　　（3）免疫共沉淀（Co-IP）检测肝癌细胞中CD147和β3GnT8的蛋白质相互作用； 　　（4）lectin blot及western blot检测肝癌细胞中β3GnT8过表达细胞及下调表达后多聚乳糖胺水平和CD147糖基化水平； 　　（5）体外transwell实验检测β3GnT8表达改变后对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响，体内裸鼠成瘤实验验证β3GnT8表达促进肝癌细胞成瘤能力； 　　（6）凝集素芯片分析β3GnT8过表达对肝癌细胞中特征性糖链表达的影响； 　　（7）MALDI-TOF质谱分析β3GnT8表达对肝癌细胞中 N-糖链结构的影响。 　　结果： 　　（1）过表达及干扰β3GnT8可分别提高和降低细胞多聚乳糖胺的表达、CD147糖基化水平； 　　（2）过表达及干扰β3GnT8可分别提高和降低细胞侵袭迁移能力，β3GnT8的表达可促进肝癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力； 　　（3）β3GnT8与糖蛋白CD147在蛋白水平有相互结合作用，β3GnT8的表达可以促进高糖型CD147的表达； 　　（4）凝集素结果显示β3GnT8的表达可增加肝癌细胞中LEL所识别的多聚乳糖胺结构，同时唾液酸化、岩藻糖修饰和N-聚糖的结构也相应增多； 　　（5）质谱结果显示β3GnT8的表达在促进肝癌细胞恶性发展的同时N-糖基化程度也加强，同时可以促进潜在N-聚糖分支结构多聚乳糖胺的延伸。 　　结论：β3GnT8的表达可以促进肝癌细胞的侵袭、迁移和成瘤性等恶性生物学表型；且能够促进糖蛋白CD147上糖基化水平以及细胞中多聚乳糖胺的表达丰度，CD147蛋白 N-聚糖多聚乳糖胺结构的合成可能是受到β3GnT8的催化；β3GnT8可能是通过调控多聚乳糖胺结构的合成以及CD147糖基化水平来实现对肝癌细胞恶性表型的影响。 　　第三部分、c-Jun对β3GnT8的转录调控研究 　　目的：借助染色质免疫共沉淀和基因共转染技术研究转录因子c-Jun对β3GnT8基因表达的转录调控作用。 　　方法： 　　（1）染色质免疫共沉淀检测HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞株中c-jun与β3GnT8的相互作用； 　　（2）构建过表达及干扰c-jun的HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞株； 　　（3）过表达及干扰c-jun表达后检测β3GnT8、多聚乳糖胺、CD147糖基化、细胞侵袭及迁移能力； 　　（4）过表达β3GnT8肝癌细胞株共转染c-jun干扰载体后检测细胞侵袭迁移能力和CD147糖基化及多聚乳糖胺表达变化。 　　结果： 　　（1）染色质免疫共沉淀结果显示，SK-Hep-1和HepG2细胞中转录因子c-Jun结合到β3GnT8基因的 promoter区； 　　（2）过表达及干扰c-jun能够调控β3GnT8的表达、CD147糖基化和多聚乳糖胺表达水平；上调及干扰c-jun可分别提高和降低肝癌细胞侵袭迁移能力； 　　（3）共转染实验表明过表达β3GnT8稳转细胞转染c-jun干扰载体后会降低自身的表达水平，同时也降低了多聚乳糖胺、CD147糖基化水平和细胞侵袭迁移能力也。 　　结论： 　　（1）转录因子c-Jun可调控肝癌细胞的侵袭迁移能力； 　　（2）转录因子c-Jun可调控β3GnT8表达，结合β3GnT8在肝癌中作用及c-Jun对肝癌细胞的侵袭迁移能力调控作用，可推断c-Jun调控肝癌细胞侵袭迁移可通过调控β3GnT8基因的表达，进一步通过多聚乳糖胺及CD147糖基化途径进行。