检索历史 清除

摘要我国是胃癌的高发区，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中均居前四位。近一半患者在诊断时已进展为晚期，从而失去手术治疗的机会。复发和转移是胃癌5年生存率低的重要原因，其复杂的分子机制有待阐明。目前，胃癌的预后仍依靠传统的病理学指标。因此，研究胃癌发生发展过程中的相关分子机制势在必行，其涉及一系列癌基因的激活和/或抑癌基因的失活，是一个多阶段多维度过程。筛查新的癌基因并研究其作用机制对寻找胃癌的早期诊断生物标记物和潜在分子治疗靶点具有重要的临床诊疗价值。<br>　　神经降压素( neurotensin，NT)是一种人体广泛分布的神经内分泌肽，神经降压素受体1( neurotensin receptors1，NTSR1)为NT的特异性高度亲和受体。近来研究发现， NT/NTSR1在多种肿瘤组织和细胞中高表达，如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌及头颈部癌，NT/NTSR1可通过多种信号途径对肿瘤的发生发展进程起明显促进作用。在肠癌、肺癌、前列腺癌中，NT/NTSR1可诱导表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号的激活，从而促进癌细胞分裂、增殖及生长。人类表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）属于表皮生长因子受体家族的重要成员之一，当HER2和EGFR共表达时，前者常与配体激活的后者结合形成异源性二聚体，与EGFR同源性二聚体相比，往往具有更高的再利用率、稳定性和传导信号的能力。目前，国内外文献鲜有关于NTSR1基因与EGFR/HER2关系的研究报告。有研究发现，在肺癌中，持续性刺激NTSR1可导致EGFR及HER2过表达与活化。<br>　　综上所述，NTSR1基因可能在胃癌的发生发展中发挥了重要的作用。目前，尚无NTSR1表达在胃癌临床病理中的意义及其对胃癌发生发展作用机制的研究。本研究旨在探索NTSR1在胃癌中表达的意义，尝试揭示其对胃癌增殖侵袭的作用，并初步探讨Cancer Phenotype信号通路相关基因及EGFR/HER2信号通路在其中的作用，为NTSR1在胃癌发生发展中的作用机制提供理论基础。<br>　　目的：<br>　　检测 NTSR1在胃癌组织及癌旁组织中的表达，并探讨其与临床病理、预后及EGFR/HER2之间的关系。检测胃癌细胞株中NTSR1表达，应用RNAi技术沉默NTSR1基因在胃癌细胞株中的表达，研究干扰NTSR1表达后胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、EGFR/HER2信号通路及Cancer Phenotype信号通路相关基因的变化，初步探讨NTSR1影响胃癌细胞增殖侵袭能力的机制。<br>　　方法：<br>　　采用免疫组织化学Envision二步法检测NTSR1、EGFR及HER2在233例胃癌组织及其配对癌旁组织中的表达。分析NTSR1蛋白表达与胃癌患者主要临床病理参数及预后之间的关系，及其与EGFR及HER2的关系。检测胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45、MKN-74，AGS及MGC-803中NTSR1 mRNA表达，选取表达丰度较高的细胞株作为实验对象。采用RNAi技术构建3条NTSR1shRNA表达载体，慢病毒感染至MKN-45细胞，Real-Time PCR法检测shRNA对NTSR1的抑制效率，并选取干扰效率最高的shRNA构建稳定株。采用MTT检测观察NTSR1基因沉默后胃癌细胞增殖能力的变化。运用流式细胞仪检测NTSR1基因对胃癌细胞凋亡的影响。采用细胞侵袭实验（Corning侵袭试剂盒）观察 NTSR1基因表达对胃癌细胞侵袭能力的影响。检测shNTSR1对Cancer Phenotype信号通路相关基因表达的影响（包括EGFR、Met、HER2、p53、Survivin、HIF-1a、Rb、MUC1、CD31(PECAM-1)、EpCAM、CD45、PCNA、VE-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin、CD44、Ki67、p27 Kip1、N-Cadherin）。Westernblot检测NTSR1对EGFR/HER2下游信号因子pErk、p-p38及pAkt的影响，初步探讨NTSR1影响胃癌细胞株增殖及侵袭能力的机制。<br>　　结果：<br>　　1.经免疫组化检测，233例胃癌中161例(69.1%)为阳性，而癌旁正常胃组织仅有31例(13.3%)阳性，其余均为阴性，癌组织表达明显上调，具有显著性差异(P<0.01)。<br>　　2. NTSR1过表达与组织分级(P=0.048)、T分期(P=0.001)、TNM分期(P=0.013)及淋巴结转移(P=0.000)呈密切正相关性，而与患者的性别、年龄、肿块大小及Lauren's分类无关。<br>　　3.233例胃癌NTSR1阳性表达与EGFR及HER2表达均存在显著正相关性(P值分别为0.045和0.002），同时EGFR与HER2两者表达亦存在显著正相关性(P=0.003）。<br>　　4.210例胃癌随访患者的1年及3年生存率分别为78.9%和68.0%，经Log-rank检验，NTSR1高表达(P=0.000)、HER2高表达(P=0.000)、低或差分化癌组织(P=0.014)、弥漫型 Lauren's分类(P=0.004)、高 T分期(P=0.026)、淋巴结有转移(P=0.000)、高临床分期(P=0.000)预后较差，经COX多因素模型检测，NTSR1高表达、HER2高表达及淋巴结转移是独立的预后性指标(偏回归系数 B分别为0.446、0.359及2.798，P分别为0.016、0.027及0.013)。<br>　　5. NTSR1在MKN-45中的表达丰度为高，在SGC-7901中的表达丰度为中等，在MKN-74，AGS，MGC-803中的表达丰度为低。<br>　　6.成功构建NTSR1 shRNA表达载体，并分别构建稳定细胞株。经shRNA干扰NTSR1表达，MKN-45的细胞增殖倍数明显下调（P<0.01）。<br>　　7.经shRNA干扰NTSR1表达，MKN-45的细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。<br>　　8.经 shRNA干扰 NTSR1表达，MKN-45的侵袭转移率显著减少（P<0.05）。<br>　　9.在MKN-45细胞中，经shRNA干扰NTSR1表达后，Cancer Phenotype信号通路中相关基因中的p27 Kip1蛋白的表达水平显著上调，同时，EGFR、HER2、EpCAM及Met也呈现较明显的下调趋势。<br>　　10．MKN-45细胞经shRNA干扰NTSR1表达后，EGFR/ HER2下游信号通路中的pErk、p-p38及pAkt蛋白均出现显著下调（P<0.05）。<br>　　结论：<br>　　本研究表明NTSR1在胃癌的发生、增殖、侵袭及转移中起着重要作用，NTSR1能促进胃癌细胞的增殖和侵袭，NTSR1可能通过多维度调控 EGFR/HER2信号通路及p27 Kip1、EpCAM、Met等Cancer Phenotype信号通路相关基因来促进胃癌细胞的增殖、侵袭及转移。