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摘要背景资料：<br>　　胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）目前定义为胃内容物反流入食管或口腔、咽喉、肺部引起的症状和并发症。在世界范围内， GERD是一种常见的疾病，亚洲相对于其他地区发病率相对较低，也超过了5%，并且在过去的几十年中， GERD的数量仍不断增加。反流性食管炎（ reflux esophagitis，RE）是一种常见的消化系统疾病，也是GERD中的一种，RE会产生多种并发症，如食管狭窄、Barrett食管以及食管腺癌。目前，关于RE的发病机理尚未清楚，但是已有研究发现年龄、性别、饮食习惯、幽门螺杆菌感染以及中枢性肥胖都会影响RE的形成，而胃内容物的过度暴露被认为是导致RE产生的主要原因，胃内容物中的氢离子能够扩散到粘膜中，并且导致粘膜组织损伤，因此，对组织内 PH的控制在RE的治疗中非常重要。<br>　　烧心和反流是 GERD最典型的症状。烧心定义为胸骨后烧灼感，反流是指胃内容物向咽部或口腔方向流动的感觉。胸痛、上腹痛、上腹烧灼感、嗳气等为GERD的不典型症状。咳嗽、咽喉症状、哮喘、牙蚀症为GERD的食管外症状。<br>　　目前，关于RE的治疗主要是通过四个方面，一是减轻胃食管的反流现象，二是降低反流物的酸性，三是促进食管发挥泵作用，四是对食管粘膜进行保护。常用的措施为：基础治疗、药物治疗、内镜治疗以及外科手术治疗等方法。<br>　　基础治疗主要是指对生活方式进行改善，包括减轻体质量、抬高床头、戒烟／戒酒、避免睡前进食、避免食用可能诱发反流症状的食物，如咖啡、巧克力、辛辣或酸性食物、高脂饮食。<br>　　药物治疗是治疗反流性食管炎最常用的方法，常见的药物有抗酸药、抑制胃酸分泌的药物、促进胃动力的药物；PPI是 GERD治疗的首选药物，单剂量PPI治疗无效可改用双倍剂量，一种 PPI无效可尝试换用另一种 PPI。70%-80%的反流性食管炎患者和60%的非糜烂性反流病患者经过8周PPI治疗后可获得完全缓解。因此 PPI疗程至少8周。对于合并食管裂孔疝的GERD患者及重度食管炎患者，PPI剂量通常需要加倍。<br>　　GERD的内镜下治疗手段主要分为射频治疗、注射或植入技术和内镜腔内胃食管成形术，但内镜治疗开展时间较短，治疗人群数量有限，其长期有效性有待进一步证实。<br>　　外科手术治疗主要用于对于PPI治疗有效但需长期服药的患者，目前最常用的抗反流手术是腹腔镜胃底折叠术。不建议对非酸反流者行手术治疗，研究显示腹腔镜下胃底折叠术能改善酸和弱酸反流，术后有较高的症状缓解率，而弱碱反流在术后反而有所增加。<br>　　微小RNA（microRNA，miRNA）是在动植物中广泛存在的一种非编码的小RNA分子，长度约为20-24个核苷酸。它能够与靶向 mRNA的3’非编码区域（untranslated regions，UTR）进行结合，在转录水平将靶基因进行降解，在翻译水平抑制蛋白质的生成。miRNA的主要作用是调节生物在生长发育过程中某些基因的表达，研究发现在肿瘤组织中， miRNA的表达水平往往会出现不同程度的上调或者下调，说明miRNA与肿瘤的发生发展有关。大量研究证明，在每一种癌症的 miRNA的表达谱都可能作为癌症诊断和预后的一种生物标记物。miRNA也能参与调节肠道细胞以及食管鳞状细胞的分化、繁殖和凋亡。miR-133b定位于人类6号染色体 P12.1中，关于 miR-133b在其他组织和癌症中的研究较多，在结肠直肠癌、胃癌、膀胱癌以及肺癌可以作为肿瘤抑癌基因，也可以作为肿瘤致癌基因在调控细胞的生长。然而，目前关于 miR-133b在 RE中的作用并未见报道。<br>　　实验目的：<br>　　本实验的主要目的是探究miR-133b在HCl诱导的人类食管鳞状细胞Het-1A损伤中的作用。首先，将Het-1A细胞置于HCl中，并探究 HCl对细胞活力以及细胞内miR-133b表达水平的影响；为进一步研究miR-133b在Het-1A细胞中的作用，利用细胞转染技术实现细胞内 miR-133b的表达上调或者下调，并探究miR-133b的表达异常对细胞活力、细胞凋亡以及凋亡相关因子的影响；最后，研究 miR-133b对细胞内细胞外信号调节激酶（ extracelliar signal-regulated kinase，ERK）和磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路的影响，为了解miR-133b在Het-1A细胞中的作用机制奠定了基础。<br>　　实验方法：<br>　　在研究 HCl对食管鳞状细胞 Het-1A活力和细胞中 miR-133b的表达水平的影响时，首先利用HCl诱导细胞，诱导时间分别为0 min、5 min、15 min和30 min，然后用四甲基偶氮唑盐（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）检测细胞活力，最后利用实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测HCl诱导30 min后的细胞和对照组细胞中miR-133b的表达水平。<br>　　在研究 miR-133b在食管鳞状细胞 Het-1A中的作用时，首先利用细胞转染技术将 miR-133b mimic、miR-133b inhibitor以及各自的对照 mimic control、inhibitor control转染到食管鳞状细胞 Het-1A中，并利用实时定量 PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测转染效果，然后采用四甲基偶氮唑盐法（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）、流式细胞术以及蛋白质印迹法（Western blot）对细胞活力、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白因子 Caspase-3、Fas和p53的表达水平进行检测。<br>　　在研究 miR-133b对细胞中 PI3K/AKT和 ERK1/2信号通路的影响时，我们将实验组细胞分为三组，分别用 HCl处理30 min，利用细胞转染技术分别转入miR-133b mimic或miR-133b mimic+inhibitor，再利用Western blot分别检测细胞中PI3K/AKT和ERK1/2信号通路中的蛋白表达水平。<br>　　实验结果：<br>　　HCl对食管鳞状细胞 Het-1A活力和细胞中miR-133b的表达水平的影响：实验结果显示，利用 HCl诱导食管鳞状细胞 Het-1A能够降低细胞活力，并且呈现一定时间依赖关系，在0-30 min内，随着培养时间的增加，细胞活力降低，当诱导30 min后细胞活力显著下降（P<0.05）；qRT-PCR检测诱导30 min后细胞中miR-133b的表达水平发现，miR-133b的表达水平与对照组相比显著上调（ P<0.001）。<br>　　miR-133b在食管鳞状细胞 Het-1A中的作用：实验结果表明，当转入miR-133b mimic后，Het-1A细胞中miR-133b的表达水平显著上调（P<0.01），而当转入miR-133b inhibitor后，miR-133b的表达水平显著下调（P<0.001）；对细胞活力进行检测发现，当培养到第3和4天时，转染miR-133b inhibitor的细胞活力与对照相比出现显著上调（P<0.01），而在转染miR-133b mimic的细胞活力与对照相比出现明显下调（P<0.01）；利用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测发现，细胞中miR-133b表达上调后，细胞的凋亡水平显著升高（P<0.001），而当细胞中 miR-133b表达下调后，细胞的凋亡水平显著下降（P<0.05）；对细胞凋亡因子的表达水平进行检测发现，在 miR-133b表达上调的细胞中， Cleaved-caspase-3、Fas以及p53的蛋白水平与对照组mimic control相比显著上调（Cleaved-caspase-3和Fas：P<0.01；p53：P<0.001），在miR-133b表达下调的细胞中，Cleaved-caspase-3、Fas以及 p53的蛋白水平与对照组 inhibitor control相比均出现显著下调（Cleaved-caspase-3和p53：P<0.05；Fas：P<0.01）。<br>　　miR-133b对细胞中信号通路的影响：结果发现，用HCl处理细胞30 min后，细胞中p-ERK1/2、p-AKT和p-PI3K的表达水平均降低，在转入miR-133b mimic的细胞中，细胞中p-ERK1/2、p-AKT和p-PI3K表达水平同样降低，当在细胞中同时转入miR-133b mimic+inhibitor后，细胞中p-ERK1/2、p-AKT和p-PI3K表达水平又出现增加；对Western blot结果进行统计分析发现，在用HCl诱导和转入 miR-133b mimic的 Het-1A细胞中，p-ERK1/2的表达水平与空白对照相比显著降低（P<0.01），p-AKT的表达水平与空白对照相比出现显著下调（P<0.001或P<0.01），p-PI3K表达水平也明显下降（P<0.05或P<0.01），当我们向细胞中同时转入miR-133b mimic+inhibitor后，p-ERK1/2、p-AKT和p-PI3K表达水平显著上调（P<0.001或P<0.01）。<br>　　实验结论：<br>　　本论文主要研究 miR-133b在 HCl诱导的食道鳞状细胞 Het-1A损伤中的作用，通过三个方面的研究，我们可以得出以下结论：<br>　　1.HCl能够降低食道鳞状细胞 Het-1A的活力并且能够显著上调细胞中miR-133b的表达水平；<br>　　2.miR-133b的表达水平下调能够增强细胞的活力，降低细胞凋亡水平和凋亡相关因子的表达，反之，当miR-133b的表达水平上调，又会降低细胞的活力，增强细胞的凋亡和凋亡相关因子的表达；<br>　　3.miR-133b mimic与 HCl都能够抑制p-ERK1/2、p-AKT和p-PI3K的表达，而miR-133b inhibitor能够减轻miR-133b mimic的这种作用。<br>　　本实验中，利用HCl成功构建了食道鳞状细胞损伤模型，并且发现miR-133b的表达出现异常，进一步研究发现，miR-133b可能是Het-1A细胞活力和凋亡的一个关键的调节因子，miR-133b的表达下调可能通过上调ERK和AKT/PI3K信号通路的活性来减轻 HCl诱导带来的细胞损伤，这也为我们深入研究 miR-133b在Het-1A细胞中的作用机制奠定了基础，也为我们治疗反流性食管炎提供了新的方向。