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摘要丹参，是一种传统的中药材。丹参酮是丹参中的主要药用成分之一，并且被广泛应用于现代医学。目前，对于丹参酮的合成途径的阐明已经初步明确。其中SmCPS1与SmKSL1是其代谢途径下游的两个关键合成基因。然而对丹参酮生物合成的特异性转录调控研究仍不清楚。本研究采用转录调控理论来试图寻找到特异性调控丹参酮生物合成的转录因子。进一步探索丹参酮生物合成的调控途径。本研究通过以 SmCPS1 与 SmKSL1 基因的启动子区作为我们的靶位调控位点在丹参的 cDNA 文库内筛选出特异性调控丹参酮生物合成的转录因子，对其功能进行了一系列的研究。其主要的得到的结论如下：<br>　　（1）我们选取了七个丹参酮含量差异明显的丹参栽培种，对其SmCPS1与SmKSL1的基因表达与丹参酮含量之间进行了关联分析，结果显示，SmCPS1与SmKSL1的基因表达与丹参酮IIA以及丹参酮I能达到显著正相关。进一步利用烟草叶片瞬时表达体系对两个基因的亚细胞定位结果显示，SmCPS1与SmKSL1均定位于细胞的质体内。<br>　　（2）本研究克隆了 SmCPS1 与 SmKSL1 上游的启动子区（KY937191 与KY937192），分别获得了5‘上游1057 bp与876bp的片段。采用在线预测分析其作用元件，结果显示;两个启动子区包含有其基本的结构元件（TATA-box，GC岛， CAAT），以及一些生长发育所必须的元件，此外，包含了一些特异性响应激素信号的元件（GARE,GCC-box，P-box），MYB转录因子结合位点（MBS）以及厌氧响应元件（ARE）等。通过PGL3荧光素酶双报告系统对其活性进行了检测，结果显示：两个启动子均具有启动活性并且活性随着5’端的长度增加而增强。随后，结合预测分析结果，我们采用烟草叶片瞬时表达体系验证了SmCPS1与SmKSL1启动子区对外源 GA 与 Eth 的响应情况。结果显示:两个启动子均能显著的响应外源GA与Eth信号。<br>　　（3）采用SmCPS1（826 bp）与SmKSL1（649 bp）启动子区构建了酵母单杂交的诱饵载体。分别转化进入酵母 Y1Hgolden 菌体内，成功构建转化株系：PYC826与PYK649。在酵母缺素培养基（SD/-Ura）上筛选出金担子毒素（AbA）的最小抑制浓度，分别为200 ng/mL与700 ng/mL，然后利用酵母Y1Hgolden体系在构建好的丹参cDNA文库里筛选转录因子。结果显示，总共有10条转录因子被筛选出来，并且均属于AP2/ERF家族。分别注释为：KY988300, MH006593, MH006594, MH006595, MH006596, MH006597, MH006598, MH006599,&nbsp;MH006600, MH006601。<br>　　（4）本实验扩增获得了筛选出来的两条AP2/ERF家族的转录因子基因的全长，按照其氨基酸序列与拟南芥 ERF 家族基因的相似度，将其分别命名为：SmERF6(KY988300)与SmERF8（MH006600）。其ORF区域分别为561 bp与654 bp。基因结构均包含有一个AP2结构域。进化分析将这两个基因分别归类于ERF IXb亚家族与VIIa亚家族。并且采用烟草叶片顺势表达体系进行了SmERF6 与SmERF8亚细胞定位，结果显示均定位于细胞核内。并且两个基因均对外源Eth与GA信号敏感（p<0.01）。组织特异性表达显示SmERF6与SmERF8分别在根与芦头内表达最高。<br>　　（5）通过酵母单杂交验证了 SmERF6 与 SmERF8 两个基因与 SmCPS1 与SmKSL1上游的启动子区的互作为阳性。并分别通过0.3 mM、0.4mMIPTG诱导下在Rossetta大肠杆菌中表达，获得了两个基因的带有MBP标签的纯化蛋白。SmERF6与SmERF8蛋白大小分别为62 KD与66 KD。并通过Werstern blotting验证了为融合了 MBP 标签的目的蛋白。采用 EMSA 体外互作验证了 SmERF6与SmERF8可以识别SmCPS1与SmKSL1上游的启动子区的GCC-box区域。<br>　　（6）利用丹参的毛状根遗传转化体系将SmERF6 与SmERF8进行过表达实验。通过PCR分子鉴定，成功获得SmERF6 与SmERF8过表达阳性转基因毛状根株系。并且在转基因株系中， SmERF6 与 SmERF8 的表达量极其显著提高（p<0.05）。靶基因(SmCPS1与SmKSL1)的表达量也显著升高（p<0.05）。SmERF6与SmERF8的过表达毛状根株系均表现为丹参酮含量（二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA）显著增加（p<0.05）。并且总酚酸与总黄酮含量下降（p<0.05），与此同时，毛状根的生长被显著抑制（p<0.05）。<br>　　（7）为了进一步确定SmERF6 与SmERF8的功能，我们利用人工microRNA靶位沉默技术在丹参毛状根体系内进行了SmERF6 与SmERF8表达的干扰实验（RNAi)。实验结果显示，人工合成的 amiRSmERF6 与 amiRSmERF8 两条microRNA被成功导入丹参毛状根内，并且amiRSmERF6 与amiRSmERF8表达量显著升高（p<0.05），靶基因SmERF6 与SmERF8的表达量显著降低（p<0.05）。随之，SmCPS1与SmKSL1的表达量也被下调（p<0.05）。并且HPLC检测结果显示，amiRSmERF6 与amiRSmERF8过表达株系内的丹参酮含量显著下降（p<0.05）。然而，总酚酸，总黄酮与丹参酮的含量之间维持了一个内稳态平衡。并且毛状根的生长正常。<br>　　（8）此外，对于SmCPS1与SmKSL1上游的启动子区的分析发现，均包含有响应GA的GRAS转录因子结合元件。因此，我们在丹参转录组数据库检索获得28条包含有GRAS结构域的EST序列。并通过RT-PCR技术获得了5条全长的SmGRAS家族的基因。并且分别命名为SmGRAS1～5（KY435886、KY435887、KY435888、KY435889、KY435890）。并且外源赤霉素（GA）与乙烯利（Eth）处理均能显著诱导五个基因的表达（p<0.05，p<0.01）。丹参酮合成关键酶基因SmCPS1与SmKSL1也对两个外源信号敏感。同时也诱导了丹参毛状根内丹参酮的含量积累（p<0.05，p<0.01）。<br>　　综上所述，本研究以调控丹参酮合成过程中的两个关键酶基因 SmCPS1 与SmKSL1 的转录表达来实现对丹参酮生物合成的转录调控。并利用 SmCPS1 与SmKSL1 的启动子作为诱饵筛选出来 SmERF6 与 SmERF8 两条特异性调控SmCPS1与SmKSL1基因表达进而参与丹参酮生物合成调控的转录因子，并利用RNAi对其进行了功能验证。同时SmGRAS基因作为调控丹参酮生物合成的候选转录因子做了初步探索。本研究为丹参酮生物合成调控机制提供了可参考依据，并且为在利用生物工程技术选育丹参酮高产的丹参种质资源提供可信的参考。