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摘要目的：<br>　　研究铜绿假单胞菌噬菌体PaP1 DNA聚合酶Gp90通过脱碱基位点损伤的动力学分子机制，有助于我们理解这种损伤对DNA复制造成DNA紊乱和突变的机制，从而为人类相关疾病的治疗奠定基础；为揭示DNA跨损伤合成、DNA修复之间的关系以及环境毒物致DNA脱碱基损伤的作用机制提供科学依据。<br>　　方法：<br>　　构建、表达和纯化Gp90 exo?，通过全长延伸、单个碱基插入和下一位碱基延伸的动力学方法研究脱碱基位点对DNA 复制效率和保真度的影响；采用前稳态前动力学方法研究DNA复制时单个碱基点插入的速度；通过表面等离子共振技术研究蛋白质与DNA间相互作用，探究脱碱基损伤对DNA聚合酶与DNA相互作用的影响。<br>　　结果：<br>　　（1）正常模板时，野生型Gp90能产生全长延伸产物和外切产物。当模板是脱碱基损伤的模板时，野生型Gp90只能产生降解产物，而没有延伸产物。Gp90 exo?进行DNA复制时，与正常模板相比，DNA聚合酶通过脱碱基位点时几乎没有全长延伸产物，两个脱碱基的模板只出现了一位28mer的延伸产物。<br>　　（2）Gp90 exo?进行单个碱基插入的稳态动力学研究，与正常模板G正确插入dCTP相比,其他三种错误dNTP的插入效率在10-4-10-5之间。对于两个脱碱基模板，Gp90 exo?插入四种核苷酸的效率都降低，错配率也增加，但是都倾向于错误插入dATP，效率大概是其他三种dNTP的2个数量级。<br>　　（3）相对于正常模板G:C配对，G:G配对导致Gp90 exo?进行下一位碱基延伸效率降低390倍。错误dATP的插入在5’端相邻为C和G的模板具有同样的效率。AP1模板，损伤的下一位碱基是C，结果显示dGTP优先的插入在AP1模板的对侧。AP2模板，损伤的下一位碱基是A，结果显示dTTP优先的插入在AP2模板的对侧。<br>　　（4）Gp90 exo?进行单个碱基插入的前稳态动力学研究，正常模板G的4种dNTP插入中，只有dCTP的插入显示出快速相，说明dCTP会优先于其他三种dNTP插入到G的对位，爆发速率kp=158 s?1；dATP、dTTP和dGTP的插入延伸量随着时间呈线性关系。而对于两个脱碱基损伤模板，只有dATP会优先插入脱碱基的对位并产生快速相kp=0.48或0.44 s?1，爆发相的速率较正常模板时的dCTP的插入速率低了350倍；而dCTP、dTTP和dGTP 的插入延伸量随着时间呈线性关系。<br>　　（5）用SPR方法测定Gp90 exo?与DNA的相互作用实验，求得平衡解离常数(Kd,DNA)。不存在dNTP和Mg2+时，正常模板G与Gp90 exo?的平衡解离常数Kd,DNA为64 nM，两个脱碱基损伤的模板与Gp90 exo?的平衡解离常数Kd,DNA分别为79 nM和85nM，提示脱碱基损伤轻微的影响Gp90 exo?与DNA的相互作用；存在dNTP和Mg2+时，正常模板G和两个脱碱基损伤模板的解离常数Kd都降低，正常G模板的解离常数Kd,DNA是16-19nM，AP1模板的解离常数Kd,DNA是43-54nM，AP2模板的解离常数Kd,DNA是50-64 nM。因此，dNTP的存在形成了比二元复合物更加稳定的三元复合物。脱碱基损伤会削弱DNA聚合酶和DNA的结合。<br>　　结论：脱碱基损伤会阻碍DNA的复制，使单个dNTP的插入和延伸速率都下降，会削弱DNA聚合酶和DNA的结合。Gp90 exo-通过脱碱基损伤主要是优先插入dATP，而没有-1位的移码框移或者骨架迁移机制。