检索历史 清除

摘要研究背景和意义：<br>　　目前心血管疾病是造成全球人类死亡的主要原因，有数据显示，2013 年全球超过173万人因患心血管疾病死亡，预计2030年这一数字预计将超过236万。缺血性心肌病（IHD）属于冠心病的一种特殊类型，其是指由于冠状动脉狭窄闭塞，以及心肌慢性缺血引起的心肌供血、供氧障碍，导致心肌收缩舒张功能受损以及心肌梗死。据统计，缺血性心肌病致死率从1990年到2013年增加了大约41.7％。因此，阐明心肌缺血过程中调控的关键因子并探寻相应的IHD防治策略是亟待解决的重要问题。<br>　　AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是细胞内非常重要的应激反应调节酶之一，细胞内能量水平的变化调节 AMPK的活性。当细胞内能量需求增加或者能量供应减少导致AMP/ATP比例失调时，将激活AMPK增强ATP合成，抑制ATP的消耗。AMPK能够通过激活其下游分子乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）来调节葡萄糖和脂肪酸代谢，以保护心肌免受缺血-再灌注损伤。在缺血-再灌注过程中，线粒体产生的大量活性氧（ROS）可以使线粒体通透性转换孔（mPTP）开放程度增加，然而开放的mPTP 致使线粒体功能发生障碍。已经有实验证明，长期的能量缺乏能够激活AMPK加速肌肉中的线粒体合成，但是激活状态的AMPK是否在缺血-再灌注过程中起到保护线粒体的生物学功能的作用仍然不清楚。<br>　　c-Jun N-末端激酶（JNK）是一种促分裂原活化蛋白激酶，是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员，其调节增殖，分化和凋亡等多种细胞功能。有实验证明，内皮细胞中AMPK激活可以通过过氧化氢降低JNK的活性。NF-κB是一种可调节基因的核转录因子，其对多种疾病过程中发生的凋亡信号通路和炎症信号通路都起到非常重要的作用，尤其是在缺血性病理情况下。已经有实验证明，在肝脏模型中，NF-κB的p65亚基通过验证反应与缺血-再灌注损伤有关。此外，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的另外两个成员，p38 MAPK以及细胞外信号调节激酶（ERK）都被认为是NF-κB的上游调控因子，参与调节炎症反应。<br>　　三者都为重要的调控因子，AMPK信号通路是否可以保护缺血-再灌注条件下的线粒体功能？AMPK信号通路是否通过ROS介导的JNK信号通路调节炎症反应？都尚待阐明。<br>　　因此，本研究构建了体外缺氧-复氧模型来模拟体内的缺血-再灌注，探讨了 AMPK信号通路对抑制炎症反应的调节，并分析相关信号机制。<br>　　目的：<br>　　①明确AMPK在缺血-再灌注过程中线粒体功能的影响；②明确AMPK在缺血-再灌注过程中对炎症反应的调节；③探讨上述生物学作用中的具体分子机制。<br>　　研究方法和结果：<br>　　1、 利用大鼠心脏成肌细胞构建体外缺氧-复氧（H/R）模型，利用药理学方法（AMPK的抑制剂Compound C，JNK的抑制剂JNK-IN-8）以及遗传学方法（AMPKα1/α2的小干扰RNA和JNK1/2小干扰RNA）证明了AMPK与JNK之间不存在相互作用的反馈调节关系，从而证明了AMPK是JNK的上游调控分子。<br>　　2、利用Seahorse XFe24细胞能量代谢分析仪（Seahorse XFe24）测量线粒体的氧消耗速率（Oxygen Consumption Rate，OCR）。实验结果表明，在缺氧-复氧胁迫条件下，激活的AMPK能够维持线粒体整体的功能，抑制氧消耗速率的降低，即可抑制基础呼吸降低，最大呼吸减少，备用呼吸量减少和ATP产量降低方面。<br>　　3、 使用ROS-ID总ROS检测试剂盒对产生的活性氧（ROS）进行测定；同时，利用流式细胞仪对线粒体通透性转换孔（mPTP）开放的开放程度进行了测定。实验结果表明，激活的AMPK 蛋白在缺氧-复氧过程中抑制活性氧（ROS）的产生，同时抑制线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放。<br>　　4、 分离得到总RNA并进行实时荧光定量PCR，对促炎症细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA水平进行分析，同时使用ELISA试剂盒测定培养基中分泌的TNF-α和IL-6的蛋白水平。实验结果表明，在缺氧-复氧胁迫条件下激活的AMPK 蛋白能够抑制p65的磷酸化，同时能够抑制促炎症细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA水平和蛋白水平。<br>　　5、 采用TUNEL和DAPI染色来检测细胞凋亡的情况，实验结果表明，激活的AMPK能够抑制缺氧-复氧（Hypo/Reoxy）过程诱导的细胞凋亡。<br>　　6、 使用二甲双胍，其通常被用于治疗糖尿病，这里作为一种AMPK的激动剂。实验结果表明，用二甲双胍预处理 H9c2 成肌细胞后可以在缺氧-复氧过程中降低JNK和p65的磷酸化水平，降低线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放程度，降低活性氧（ROS）产生，降低促炎症细胞因子TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白水平。<br>　　结论：<br>　　在缺氧-复氧应激条件下，激活的AMPK能够调节JNK以及NF-κB信号级联反应。心脏中激活的AMPK 在维持缺血后线粒体的正常功能和抑制由缺血性损伤引起的炎症反应中发挥了关键作用。