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摘要糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是一种严重的糖尿病微血管并发症，是引起终末期肾病的主要原因，发病因素复杂，对单个基因的研究很难彻底阐明其发病机制。近年来，随着系统生物学方法的兴起及高通量数据的积累，应用分子网络研究致病基因在疾病发生过程中的所起到的作用成为可能，基于此，力图从复杂网络角度理解疾病发生、发展规律的方法应运而生。如何通过分子网络探寻疾病相关基因，寻找药物作用靶标成为应用网络方法研究复杂疾病的关键问题。<br>　　本研究以蛋白质相互作用网络为研究核心，研究了筛选DN相关基因的若干核心问题。由于RNA表达与蛋白质表达所存在的相关性，允许基于mRNA的表达进行蛋白层面的研究，所以我们依托二代测序（Next-Generation Sequencing,NGS）技术检测DN小鼠相对其正常对照小鼠差异表达mRNA及蛋白质相互作用数据库构建了DN相关蛋白质相互作用网络（DN Protein-protein interaction network,DNPPIN），接着依据系统生物学方法筛选出在网络中处于重要位置的9个候选基因，最后通过对比其保守性等特征及qRT-PCR检测其在DN小鼠肾脏组织和四种肾脏固有细胞中的表达水平，筛选出一个重要基因活化蛋白激酶C受体1（Receptor for Activated C Kinase1,Rack1），蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）βⅡ亚基受体，并对其对糖尿病肾病炎症因子表达调控作用进行了研究。<br>　　经过几十年的研究，越来越多的证据表明，DN涉及众多基因的突变，其发病过程涉及细胞内分子网络的综合变化。站在复杂网络的角度，通过对网络中分子相互关系进行分析，从而发现具有关键作用的生物分子是网络分析的本质问题。通过整合DN相关基因表达的差异性及蛋白质相互作用信息，可以实现DNPPIN的快速构建。论文第一部分提出了一种基于基因表达差异性及相关性识别关键基因的方法。基于此方法及网络拓扑相关指标，共发现9个可能在糖尿病肾病发生、发展过程起关键作用的基因。<br>　　新近研究发现，持续的高糖环境能够诱发炎症反应的发生，造成过量的免疫细胞产生及炎症因子分泌，对DN的发生、发展起到一定的促进作用。相关研究表明，PKCβ亚基活化与DN发生密切相关，作为PKCβ亚基的活化受体的Rack1在DN发生过程中多起到的作用引起了我们的关注。论文第二部分主要探讨Rack1对DN炎症因子表达的调节过程。<br>　　综上所述，我们通过蛋白质相互作用网络分析预测了可能与DN相关的基因，并进一步对Rack1对DN炎症因子表达的调节作用进行了研究。<br>　　第一部分糖尿病肾病蛋白质相互作用网络的构建、分析及验证<br>　　目的：<br>　　检测糖尿病肾病小鼠差异表达基因，构建糖尿病肾病小鼠蛋白质相互作用网络；筛选可能在糖尿病肾病发生、发展起关键作用的基因。<br>　　方法：<br>　　通过高通量NGS技术，获得在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中差异表达的信使RNA（messager RNA，mRNA）；通过STRING数据库获得小鼠蛋白质相互作用；通过 BioMart完成不同数据库间的数据转换；通过R及Cytoscape构建并可视化DNPPIN；应用Cytoscape插件Network Analyzer及CytoNCA计算网络中心性参数：度中心性（Degree Centrality,Degree）、中介数中心性（Betweenness Centrality,Betweenness）、接近中心性（Closeness Centrality,Closeness）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality,Eigenvector）；利用R对网络进行鲁棒性（Robustness）分析;应用 MCODE对网络进行模块化（Module）分析；应用在线软件KOBAS对DNPPIN第1层级模块进行基因本体论（ Gene ontology,GO）及京都基因和基因组百科全书通路(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes Pathway,KEGG)分析；应用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qRT-PCR）验证9个DN相关预测基因在 DN小鼠肾脏组织及4种高糖培养的肾脏固有细胞中的表达水平。<br>　　结果：<br>　　应用NGS技术，获得DN差异表达的mRNA；通过构建和分析DNPPIN，获得9个在网络中处于关键位置的基因；qRT-PCR结果表明9个预测基因mRNA在肾脏组织表达趋势与NGS趋势完全一致；Rack1与 Polr2e在4种肾脏固有细胞中表达趋势完全一致，且Rack1表达水平及保守性更高，为后续进一步分析提供了依据。<br>　　结论：<br>　　DN相关蛋白质相互作用网络可用于鉴定在DN发生中可能起重要作用的基因；结构高度保守Rack1，在肾脏组织及肾脏细胞中表达差异明显且稳定，可能在DN发生、发展中起到重要作用。<br>　　第二部分Rack1促进糖尿病肾病炎症因子的表达<br>　　目的：<br>　　探讨Rack1在高糖培养下系膜细胞（Mesangial cell,MC）中的差异表达水平及基本特征；探讨Rack1对高糖培养MC炎症因子表达的影响。<br>　　方法：<br>　　构建过表达质粒pcDNA3.1(+)-Rack1，设计并合成Rack1小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），通过脂质体介导的方法将Rack1 siRNA及pcDNA3.1(+)-Rack1分别转染至高、低糖培养的小鼠肾小球系膜细胞中，qRT-PCR检测转染效率；Western-blot法检测Rack1蛋白相对表达水平；qRT-PCR法检测炎症相关因子mRNA的表达水平，酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，Elisa）法测定炎症相关因子蛋白质表达水平。<br>　　结果：<br>　　Western blot结果表明，与低糖组相比较，Rack1在高糖培养的MC中显著增高（p<0.05）；将pcDNA3.1(+)-Rack1过表达质粒转染至低糖培养的系膜细胞，与低糖空白对照组及空载质粒对照组相比，低糖Rack1过表达组中炎症相关因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein1，MCP-1）mRNA表达水平显著增高（p均<0.05）；将Rack1siRNA转染至高糖培养的系膜细胞，与高糖空白对照组及siRNA对照组相比，高糖Rack1沉默组中TNF-α、MCP-1mRNA表达水平显著降低（p均<0.05），ELISA检测结果与其相一致。<br>　　结论：<br>　　Rack1在糖尿病肾病小鼠肾脏和高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞中表达水平显著升高（p<0.05）；Rack1对高糖培养的肾小球系膜细胞炎症因子的表达具有促进作用(p<0.05)。