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摘要第一部分：构建稳定过表达Lrtm1基因的C2C12细胞系<br>　　目的：<br>　　1.构建小鼠Lrtm1基因表达载体。<br>　　2.筛选稳定表达外源性Lrtm1基因细胞株。<br>　　3.验证商品化Lrtm1抗体特异性。<br>　　方法：<br>　　1.构建成肌分化模型。<br>　　2.诱导C2C12细胞系分化后Hoechst染色，观察肌管形成。<br>　　3.C2C12细胞瞬时过表达Lrtm1、GFP质粒。<br>　　4.重组表达载体pLJM1-Lrtm1-DDK的构建：<br>　　（1）PCR扩增小鼠Lrtm1基因。<br>　　（2）用AgeI、EcoRI酶切pLJM1-GFP载体。<br>　　（3）目的片段与载体连接。<br>　　5.慢病毒包装。<br>　　6.构建稳定过表达Lrtm1基因C2C12细胞系。<br>　　8.商品化Lrtm1抗体特异性的验证。<br>　　9.观察截短体Lrtm1蛋白质位置。<br>　　结果：<br>　　1.肌管由多个细胞融合而成。<br>　　2.Real-time PCR检测到Myogenin、Myosin、Lrtm1基因mRNA水平在分化过程中升高。<br>　　3.C2C12细胞瞬时转染效率低。<br>　　4.成功扩增小鼠Lrtm1基因。<br>　　5.pLJM1-GFP载体双酶切成功。<br>　　6.成功挑选出连接Lrtm1基因的阳性克隆。<br>　　7.测序重组质粒pLJM1-Lrtm1-DDK质粒结果与Lrtm1 CDS序列比对成功。<br>　　8.重组质粒pLJM1-Lrtm1-DDK在HEK293T细胞中表达。<br>　　9.Real-time PCR检测到C2C12-Lrtm1-DDK细胞系Lrtm1 mRNA表达水平。<br>　　10.商品化Lrtm1抗体特异性识别差。<br>　　11.Western blot检测到截短体Lrtm1蛋白质表达。<br>　　结论：<br>　　1.成功构建慢病毒表达载体pLJM1-Lrtm1-DDK。<br>　　2.慢病毒感染筛选到C2C12-Lrtm1细胞系。<br>　　第二部分：Lrtm1基因在成肌分化过程中的功能探索<br>　　目的：<br>　　1.诱导分化稳定细胞系后观察过表达Lrtm1基因对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin以及调控因子MYF5、MyoD、MEF2D等的影响。<br>　　2.明确Lrtm1蛋白质表达水平在C2C12细胞中受调控的机制。<br>　　方法：<br>　　1.检测Lrtm1基因对成肌分化过程的影响<br>　　（1）诱导稳定细胞系分化，Real-time PCR、Western blot检测稳定过表达Lrtm1基因对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin的影响。<br>　　（2）在稳定细胞系中检测成肌调控因子、PAX3、PAX7等mRNA表达水平，探索Lrtm1基因影响成肌分化过程的具体机制。<br>　　2.探索Lrtm1蛋白质表达水平通路调节机制<br>　　（1）C2C12-Lrtm1细胞系中，对比MG132处理，对外源性Lrtm1蛋白质表达水平的影响。<br>　　（2）在C2C12、HEK293T细胞瞬时过表达外源性Lrtm1基因，对比MG132处理与否，检测外源性Lrtm1蛋白质表达水平。<br>　　结果：<br>　　1.过表达Lrtm1基因在蛋白质水平、mRNA水平对成肌分化标志基因Myogenin、Myosin的表达均有抑制作用。<br>　　2.在外源过表达Lrtm1基因促进成肌分化基因PAX3、MyoD的mRNA表达水平有促进作用。<br>　　3.C2C12细胞中Lrtm1蛋白质水平受蛋白酶体调控。<br>　　结论：<br>　　1.Lrtm1基因在成肌分化过程中随分化进行表达逐渐升高。<br>　　2.过表达Lrtm1基因抑制Myogenin、Myosin基因的表达。<br>　　3.过表达Lrtm1基因促进PAX3基因的表达。<br>　　4.C2C12细胞中Lrtm1蛋白质表达水平受蛋白酶体调控。