检索历史 清除

摘要研究背景与目的<br>　　小电导Ca2+激活K+通道（small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel）是唯一通过细胞内Ca2+激活的非电压依赖性K+通道。根据其对蜂毒明肽（apamin）敏感性不同可划分为 SK1、SK2、SK3和SK4 四种亚型，心肌细胞可表达SK2通道。已有研究结果显示SK2通道是参与动作电位复极化末期的重要离子通道，此期是临床心律失常发生的敏感时期。因此研究SK2通道对于认识心律失常的病理机制具有重要意义。<br>　　功能性SK2通道由4个α亚单位构成，每一个亚单位均分为跨膜区（S1-S6）、一个孔形成区和胞浆C-末端、N-末端，C-末端含有钙调蛋白(Calmodulin，CaM)的结合区。离子通道都是由多个亚单位构成的复合体，均含有孔形成单位和附属亚单位，而后者通过与一些支撑蛋白和调节蛋白相互作用从而维持或调节通道的功能。因此，为探讨 SK2 通道的分子调控机理，我们实验室在心肌组织和转染的HEK293细胞中观察到SK2和Junctophilin2（JP2，JPH2）有相互作用和共定位。并且JP2不影响SK2蛋白在HEK293细胞总蛋白的表达，却增加了细胞膜上的表达，敲减成年小鼠心肌细胞JP2的表达显著降低SK2通道的钾电流。<br>　　JP是近年来研究发现的，它是存在于细胞膜与内（肌）质网（SR/ER）之间的耦联膜复合体(junctional membrane complex，JMC)的重要组成蛋白分子，其主要功能是在JMC中使细胞膜和肌质网保持一个较固定的距离，从而维持细胞内Ca2+稳态，为二者之间的信号转导提供结构基础。哺乳动物具有JP1、JP2、JP3、JP4四种亚型，JP1、JP2可分布在骨骼肌和心肌。JP结构包括N-末端区、α螺旋样区和C-末端区，N-末端区含有8个重复序列的MORN结构域，后者划分为2个区域：MORN1（MORN motifsⅠ～Ⅵ）和MORN2MORN motifsⅦ～Ⅷ），被预测为与细胞膜表面离子通道耦联的结构域。<br>　　本实验室之前体内和体外研究均提示，JP2和SK2之间有相互作用，JP2对心肌细胞膜SK2通道功能具有调节作用。那么JP是否通过N-末端的MORN结构域与细胞膜SK2通道发生耦联作用，而SK2又是通过哪一段与JP2发生相互作用？目前未见相关研究。本实验拟将SK2与JP2按结构特点分成三个片段，构建酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-SK2-X：pGBKT7-SK2-N（aa 1-145，包含N-末端）、pGBKT7-SK2-M（aa 141-390，包含跨膜区段）、pGBKT7-SK2-C(aa 380-580，包含 C-末端)及捕获表达质粒 pGADT7-JP2-Y：pGADT7-JP2-N（aa 1-253，包括MORN1区）、pGADT7-JP2-M（aa 216-350，包括MORN2区）、pGADT7-JP2-C（aa 340-696），经过PCR、双酶切和基因测序的方法鉴定重组质粒构建成功后，采用酵母双杂交技术在体外验证SK2与JP2之间相互作用的区域。从而为理解SK2通道的分子调控机制提供理论依据。<br>　　材料与方法<br>　　1. 酵母双杂交诱饵表达质粒及捕获表达质粒的构建：根据SK2和JP2全基因序列以及结构特点，将SK2和JP2分为三段，用限制性内切酶Ndel和BamHI双酶切 pGBKT7、pGADT7 载体质粒，构建诱饵表达质粒 pGBKT7-SK2-N（aa 1-145，包含N-末端）、pGBKT7-SK2-M（aa 141-390，包含跨膜区段）、pGBKT7-SK2-C（aa 380-580，包含C-末端）及捕获表达质粒pGADT7-JP2-N（aa 1-253，包括MORN1区）、pGADT7-JP2-M（aa 216-350，包括MORN2区）、pGADT7-JP2-C（aa 340-696），并在片段C末端连接标签蛋白HA。并采用PCR法、双酶切法及测序鉴定6个重组质粒。<br>　　2. 醋酸锂法制备酵母感受态细胞 AH109：挑取 YPDA 固体培养基中的AH109单克隆，接种于YPDA液体培养基，经重悬、离心沉淀获得感受态酵母菌株AH109。<br>　　3. 重组酵母表达载体毒性检测：采用醋酸锂介导法将重组诱饵表达载体pGBKT7-SK2-X及空载体pGBKT7、重组捕获表达载体pGADT7-JP2-Y及空载体pGADT7分别转化感受态酵母AH109细胞，采用SD/-Trp、SD/-Leu营养缺陷型固体培养基检测重组表达载体对宿主菌AH109感受态细胞是否具有毒性。<br>　　4. 重组酵母表达载体自激活检测：为检测重组诱饵质粒对于宿主菌报告基因的自主激活作用，用醋酸锂介导法在AH109酵母感受态细胞中分别转化5组质粒：pGBKT7-SK2-Y+pGADT7、pGBKT7-p53+pGADT7-T （阳性对照）、pGBKT7-p53+pGADT7-LaminA （阴 性 对 照)，用 SD/-Trp-Leu 和SD/-Trp-Leu-Ade-His/X-α-gal营养缺陷型固体培养基进行鉴定；捕获质粒采用同样的方法，5组配对为：pGBKT7+pGADT7-JP2-Y、pGBKT7-p53+pGADT7-T（阳性对照）、pGBKT7-p53+pGADT7-LaminA（阴性对照）。<br>　　5. 重组酵母表达载体在 AH109 细胞的表达鉴定：将重组诱饵表达载体pGBKT7-SK2-X、pGADT7-JPH2-Y 采用醋酸锂介导法分别转化感受态酵母AH109细胞，通过SD/-Trp、SD/-Leu营养缺陷型固体培养、挑菌、扩增，提取蛋白，用特异性HA抗体通过Western blotting检测目的基因是否表达。<br>　　6. 共转化鉴定SK2与JP2相互作用的片段：将pGBKT7-SK2-X的3个重组质粒分别与pGADT7-JP2-Y的3个重组质粒两两配对，共转化酵母菌AHl09。通过 SD/-Trp-Leu-Ade-His/X-α-gal 营养缺陷型固体培养基观察酵母菌有无生长和蓝白显色鉴定双杂交结果。<br>　　结果<br>　　1. 双酶切及测序结果显示3个酵母诱饵表达质粒pGBKT7-SK2-X及3个捕获表达质粒pGADT7-JP2-Y构建成功。<br>　　2. 与空载体 pGBKT7 和 pGADT7 转化组相比，诱饵重组质粒pGBKT7-SK2-X及捕获重组质粒pGADT7-JP2-Y的酵母细胞克隆体积和数量均与空载体对照组相似，挑取单克隆培养24h后OD值也接近空载体对照组，表明重组诱饵表达质粒对宿主菌AH109没有毒性。<br>　　3. 诱饵质粒与捕获质粒转化组均能在 SD/-Trp-Leu 平板中生长，而在SD/-Trp-Leu-Ade-His/X-α-gal 固体培养基中只有阳性对照组出现酵母克隆且变蓝，阴性对照和重组质粒转化组均无克隆出现，提示重组质粒不能自主激活报告基因<br>　　4.将重组质粒转染酵母菌AH109，提取蛋白后的Western blotting结果显示SK2三个片段和JP2三个片段均有表达。<br>　　5. pGBKT7-SK2-X和pGADT7-JP2-Y共转化感受态酵母菌AHl09，无阳性蓝色菌落生长，没有检测到SK2通道蛋白的三个片段与JP2蛋白的三个片段之间有直接相互作用。<br>　　结论<br>　　本研究根据SK2和JP2的全基因序列以及结构特点，成功构建了酵母菌表达载体pGBKT7-SK2-N、pGBKT7-SK2-M、pGBKT7-SK2-C、pGADT7-JP2-N、pGADT7-JP2-M、pGADT7-JP2-C；通过毒性和自激活检测重组质粒适用于酵母双杂交系统，Western blotting鉴定也显示有相应的SK2和JP2蛋白片段的表达；但未发现SK2和JP2蛋白片段之间有相互作用。