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摘要【背景】<br>　　原发性肝细胞肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，也是肝硬化患者的主要死亡原因，尽管目前的外科治疗水平不断提升，但其复发的原因仍未探明。目前研究发现可能存在某些基因在肝细胞肝癌的增殖和迁移中起到关键作用。然而有关这些基因调控的研究十分有限。<br>　　Tg737基因，首先是在海藻中被发现，目前被认为是多种癌症中的肿瘤抑制基因，如肝癌、肾癌和胰腺癌。已有研究在肝细胞肝癌患者中发现Tg737基因在59%的癌组织中发生下调。该基因可能参与人类或啮齿类动物肝脏肿瘤的发生及转变。前期调查研究发现，Tg737参与调控肝癌细胞株HepG2和MHCC97H在缺氧条件下导致的侵袭和转移的能力变化，抑制Tg737可通过促进细胞周期进程和细胞分化阻滞导致胎肝干细胞/祖细胞向肿瘤干细胞的恶性转化。然而，在上述研究中，关于Tg737的调控因子仍未明确。<br>　　近年来，miRNAs逐渐发展成为重要的内源性转录后基因调控子。许多miRNA在肿瘤发生与发展中发挥重要作用。在肝细胞肝癌中，许多miRNAs如miR-34a， miR-122，miR-199a 和 miR-200，均被证明与肿瘤多项生物学功能的调控相关，具体包括肿瘤的增殖、迁移和侵袭。相反miR-21，miR-148a和miR-221作为参与肿瘤发生的相关miRNA，与许多肿瘤抑制基因存在潜在的相关性。以上研究均提示了miRNA在肝细胞肝癌成瘤中的作用。<br>　　MiR-548是一个较大的、低保守性的灵长类特异性miRNA家族，该家族包含68个hsa-miR-548家族成员。研究认为miR-548c-3p是前列腺癌的功能生物标记物来源。在幽门螺杆菌阴性的胃癌组织中，发现miR-548c-3p明显出现表达上调。另外，前期工作中我们已经在肝细胞肝癌的组织及细胞中发现miR-548a-5p的高表达。然而， miR-548a-5p具体是如何对肝细胞肝癌发挥相关作用的具体机制目前仍不清楚。<br>　　通过利用生物信息分析发现Tg737是miR-548a-5p的潜在靶标。本研究最直接的目的就是调查Tg737是否与肝细胞肝癌的细胞增殖和凋亡相关，以及在肝细胞肝癌中Tg737是否被miR-548a-5p调控。<br>　　【目的】<br>　　探究miR-548a-5p是否通过靶向调控Tg737分子提高肝癌细胞增殖并抑制其凋亡。检测下调Tg737后对肝癌细胞增殖的影响；探究miR-548a-5p对Tg737分子的靶向调控机制；检测miR-548a-5p对肝癌细胞增殖、凋亡的影响；在肝癌细胞中，当miR-548a-5p抑制Tg737分子表达后，重新恢复Tg737分子表达，检测肝癌细胞增殖能力变化情况。<br>　　【方法】<br>　　1. 通过平板克隆实验、CCK-8实验和细胞周期检测验证Tg737在肝癌细胞系中的功能。<br>　　2. 利用蛋白印迹实验、qRT-PCR及双荧光素酶检测分析miR-548a-5p与下游靶点Tg737的相互作用。<br>　　3. 通过平板克隆实验、CCK-8实验和细胞周期检测验证miR-548a-5p对肝癌细胞系的影响；并在裸鼠皮下接种转染的HepG2细胞，从而评估miR-548a-5p对体内肿瘤生长的作用。并通过流式细胞检测方法评价了miR-548a-5p对肝癌细胞凋亡的作用。<br>　　4. 利用蛋白印迹实验和细胞周期检测验证在肝癌细胞中，当miR-548a-5p抑制Tg737分子表达后，重新恢复Tg737分子表达对肝癌细胞的影响。<br>　　【结果】<br>　　1. 在肝癌细胞系中下调Tg737后，细胞的增殖能力明显升高，集落形成能力明显增强，细胞周期检测发现Tg737下调后G0/G1期的细胞显著减少，S期的细胞显著增多。<br>　　2. 在肝癌细胞系中过表达miR-548a-5p后，Tg737蛋白和mRNA的表达量明显减低，且miR-548a-5p能够显著减低Tg737-3'UTR荧光素酶活性。<br>　　3. 肝癌患者中，与癌旁组织相比，Tg737的蛋白和mRNA水平在肝癌组织中明显减低，而miR-548a-5p在肝癌组织中表达量明显升高。<br>　　4. 在肝癌细胞系中，过表达miR-548a-5p后细胞的增殖能力明显升高，集落形成能力明显增强，此时处于G0/G1期的细胞显著减少，而S期的细胞显著增多。<br>　　5. 接种表达miR-548a-5p的HepG2细胞的裸鼠，其成瘤组织的体积和重量均较对照组的裸鼠大。<br>　　6. 在肝癌细胞系中下调miR-548a-5p，细胞凋亡数增加，上调miR-548a-5p，细胞凋亡数减少。<br>　　7. 在上调miR-548a-5p的肝癌细胞系中恢复Tg737的表达，处于G0/G1期细胞数显著升高，S期细胞数显著减低。<br>　　【结论】<br>　　Tg737能够抑制肝癌细胞的增殖，而miR-548a-5p无论在体内或体外实验中均可促进肝癌细胞的增殖，下调miR-548a-5p的靶基因Tg737可促进肝癌细胞增殖。与Tg737下调相似，miR-548a-5p过表达显著增强肝细胞肝癌的细胞增殖、集落形成能力并抑制细胞凋亡。miR-548a-5p通过与Tg737的3’UTR作用下调其靶基因的表达，在肝癌患者组织样本中检测到了miR-548a-5p与Tg737水平呈负相关。更重要的是，在肝癌细胞中，恢复Tg737的表达可显著抑制miR-548a-5p诱导的细胞增殖作用。总之，miR-548a-5p负调控肿瘤抑制基因Tg737，促进肿瘤发生，提示 miR-548a-5p可发展成为肝细胞肝癌的潜在新型治疗靶点。