tDCS对缺血性脑卒中大鼠运动功能康复的促进作用及机制研究-论文-万方医学网

tDCS对缺血性脑卒中大鼠运动功能康复的促进作用及机制研究

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摘要研究背景 　　脑卒中是由脑血管堵塞或破裂导致脑供血不足而引发的一系列脑组织缺血缺氧性改变，是最常见的中枢神经系统疾病之一，具有高致死率、致伤率和致残率的特点。随着社会老龄化的加剧，脑卒中已成为60岁以上人群的首位致死性疾病[1, 2]，其中缺血性脑卒中占该类疾病的80%[3]。据报道，超过2/3的脑卒中患者饱受卒中后遗症的折磨[4]。运动功能障碍、学习记忆能力损伤、失语症等卒中后遗症不仅严重影响患者的生活质量[5]，对社会和家庭也造成了沉重的经济负担。 　　目前，虽然静脉注射纤溶酶原激活剂和血管内介入取栓等方法在缺血性脑卒中治疗方面表现出了较好的疗效，但是由于治疗时间窗（卒中发生后4.5 h内）的严格限制[6, 7]，对很多患者并不适用。其他治疗方式[8]如：亚低温脑保护，脑水肿脱水治疗、神经营养因子治疗和改善微循环等对症支持治疗，只能减轻继发脑损伤，对已形成的损伤和神经功能缺失疗效有限。干细胞移植技术虽然在基础和临床研究中被证实具有促进组织修复的巨大潜力[9-12]，但在实际应用中因存在免疫排斥、移植后存活率低、致瘤等问题[13]，限制了其临床转化和推广应用。研究发现，内源性神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）在脑损伤后会出现增殖，但增殖水平有限，尚无法实现神经组织再生和功能重建[14]。因而，如何促进损伤后体内固有的NSCs增殖、迁移和定向分化，已经成为神经再生和脑损伤修复领域的研究热点。 　　经颅直流电刺激（Transcranial direct current stimulation，tDCS）是利用恒定、低强度直流电（≤2 mA）调节大脑皮层神经元电活动的一种物理治疗技术，具有操作简单、安全、无创等优势。最新研究显示[15, 16]，tDCS对脑卒中后运动功能障碍的康复具有显著促进作用，但因机制尚不明确，限制了其向临床应用转化。因此，本课题以国际公认的缺血性脑卒中动物模型为研究对象，评价了tDCS对运动功能障碍康复的促进作用并从神经再生和神经保护两个方面探讨了其作用机制。 　　研究目的 　　明确tDCS对运动功能障碍康复的促进作用，并初步阐明其作用机制，为tDCS的临床转化和推广应用提供理论和实验依据。 　　第一部分 tDCS的生物安全性研究 　　材料与方法 　　1. 动物分组：健康成年雄性SD大鼠24只，随机分为对照组（Control，n=12）和经颅直流电刺激组（tDCS，n=12）。 　　2. 刺激电极植入与tDCS处理： 　　2.1 大鼠经1%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，切开头部皮肤、去除皮下组织后充分暴露颅骨，将自制杯状刺激电极（接触面积3.5 mm2）通过骨水泥固定于右侧初级运动皮层M1区对应的颅骨表面，坐标位置为：AP+2.0 mm，ML+2.0 mm。 　　2.2 实施tDCS处理时，首先将杯状刺激电极内注入生理盐水，然后与直流电刺激仪相连，参照电极（圆型橡皮板电极，接触面积为7.0 cm2）固定于动物胸部。tDCS组大鼠接受两个阶段的阴极tDCS处理（电流强度500 μA，15 min/次，1次/d），每个阶段5 d，两阶段间隔2 d。Control组大鼠仅与刺激仪相连，但无电流输出。整个刺激过程中实验动物处于清醒状态。 　　3. 检测方法：通过计算机模拟仿真技术研究tDCS过程中电流密度在头部的分布情况；采用旷场、转棒、水迷宫等行为学实验方法研究tDCS对健康大鼠脑功能的影响；利用血液学、血生化、形态学、神经递质检测和脑温监测等方法评价tDCS的神经毒性和对大鼠一般健康状况的影响。 　　研究结果 　　1. 电流密度分布情况：不同组织中电流密度分布存在较大差异，其中脑组织的电流密度为20 A/m2，颅骨电流密度为40-60 A/m2。 　　2. 行为学检测结果：与Control组相比，tDCS组大鼠在旷场内的总运动距离和转棒停留时间均无明显差异；在水迷宫实验中，两组动物达到平台潜伏期和目标象限停留时间无明显差异。上述结果表明，本实验条件下的tDCS对健康大鼠运动功能和学习记忆能力无明显影响。 　　3. 形态学、血液学和血生化检测结果：HE染色结果显示，与Control组相比，tDCS组大鼠重要脏器（心、肺、肝、脾、肾）的形态结构无明显改变。血液学检测结果显示，两组大鼠血常规指标无明显差异。血生化检测结果显示，两组大鼠血清肝、肾功能指标无显著差异。上述结果表明，本实验条件下的tDCS对健康大鼠重要脏器的形态结构及造血、肝肾功能无明显影响。 　　4. 脑组织形态、神经递质及脑温检测结果：脑组织 HE 和尼氏染色结果显示，与Control组相比，tDCS组大鼠大脑皮层和海马区神经细胞的形态结构及尼氏体的形态和密度无显著改变。液质联用法对大鼠大脑皮层和海马组织神经递质的检测结果显示，Control 组和 tDCS 组之间没有显著差异。此外，热成像仪的检测结果显示，与Control 组相比，tDCS 组大鼠脑温没有明显改变。上述结果表明，本实验条件下的tDCS对健康大鼠不会产生神经毒性。 　　第二部分 tDCS对缺血性脑卒中导致的大鼠运动功能障碍康复的促进作用研究 　　材料与方法 　　1. 刺激电极植入手术：健康成年雄性SD大鼠175只，经1%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，切开头部皮肤、去除皮下组织后充分暴露颅骨，将自制杯状刺激电极（接触面积3.5 mm2）通过骨水泥固定于右侧初级运动皮层M1区对应的颅骨表面，坐标位置为：AP+2.0 mm，ML+2.0 mm。 　　2. 缺血性脑卒中模型建立和分组：植入刺激电极的SD大鼠，经1%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，充分暴露右侧颈总动脉，游离颈内动脉与颈外动脉，于颈外动脉远心端剪一缺口，将硅胶头端尼龙栓线经颈外动脉缺口—颈内、颈外动脉分岔口—颈内动脉颅底段插至大脑中动脉起始段，阻塞大脑中动脉（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）血流2 h后拔出栓线制成大鼠缺血性脑卒中模型，即MCAO模型，随后通过Zea longa评分从117只MCAO模型大鼠中筛选出62只中度脑损伤大鼠并随机分两个实验组：MCAO手术 +tDCS治疗组（MCAO+tDCS，n=32）和MCAO手术 + 假tDCS治疗组（MCAO+Sham，n=30）；另外58只植入电极的大鼠接受假MCAO手术，即仅暴露颈部血管并缝合，之后随机分为两个对照组：Control+tDCS组（n=29）和Control+Sham组（n=29）。 　　3. tDCS处理：MCAO术后第二天（2-day post MCAO operation，POD 2）实施tDCS，方法同第一部分。 　　4. 检测方法：采用旷场、转棒、足迹分析等行为学实验，检测大鼠在MCAO手术前行为数据的基线水平，之后每两天检测一次，以评价tDCS对MCAO大鼠运动功能障碍康复的促进作用。 　　研究结果 　　1. tDCS 对缺血性脑卒中大鼠自发运动功能康复的影响：旷场实验结果显示，与两个 Control 组相比，MCAO 组大鼠在旷场内的总运动距离显著降低（P< 0.05）。与MCAO+Sham组相比，MCAO+tDCS组大鼠在旷场内的总运动距离显著增加（P<0.05）。Control+Sham组和Control+tDCS相比，旷场内运动总距离无明显差异。 　　2. tDCS对缺血性脑卒中大鼠运动耐力康复的影响：转棒实验结果显示，MCAO组大鼠在转棒上的停留时间较两个Control组显著缩短（P < 0.01）。tDCS连续治疗5 d后，MCAO+tDCS组大鼠在转棒上的停留时间明显延长，与MCAO+Sham组相比有显著差异（P<0.01）。Control+Sham组和Control+tDCS相比，大鼠转棒停留时间无明显差异。 　　3. tDCS 处理对缺血性脑卒中大鼠跛行步态康复的影响：足迹分析结果显示，与两个Control组相比，MCAO组大鼠患肢足底面积和步幅均显著降低（P<0.01），tDCS治疗后，MCAO+tDCS组大鼠患肢步幅和足底面积康复速度明显加快，与MCAO+Sham组相比有显著差异（P<0.05）。Control+Sham组和Control+tDCS相比，大鼠足迹分析结果（足底面积和步幅）无明显差异。 　　第三部分 tDCS对缺血性脑卒中大鼠神经发生的影响及信号通路研究 　　材料与方法 　　1. 用于第二部分实验的SD大鼠在行为学实验结束后进行第三部分实验研究。 　　2. 检测方法：在MCAO术后第3天（POD 3）利用2,3,5-triphenyltetrazolium chloride （TTC）染色检测脑组织缺血损伤面积；在POD 3和POD 7，通过免疫荧光组织化学染色（Immunofluorescence staining confocal，IFC）技术研究tDCS治疗对NSCs增殖、迁移和分化的影响；在POD 14，利用透射电镜（Transmission electron microscope， TEM）和蛋白电泳（Western blot，WB）实验检测有髓神经纤维数量、厚度和髓鞘相关蛋白的表达；通过IFC和WB实验检测tDCS治疗对NSCs的Notch1通路相关蛋白表达和分布的影响。 　　研究结果 　　1. tDCS对缺血损伤侧室管膜下区（Subependymal region，SVZ）NSCs增殖和迁移的影响：TTC染色和IFC结果显示，在POD 3，MCAO+tDCS组大鼠梗死的纹状体内出现了大量Nestin+细胞（NSCs的标志物），与MCAO + Sham组相比差异具有显著性（P<0.01）。两个Control组动物的纹状体中未观察到Nestin+细胞。IFC结果显示，在 POD 3 和 POD 7，MCAO 组大鼠 SVZ 区 Nestin+/Ki67+细胞百分比与两个Control组相比显著增加（P< 0.01）；tDCS处理后，MCAO + tDCS组大鼠SVZ区Nestin+/Ki67+细胞百分比较MCAO+Sham组显著增加（P<0.01）。Nestin+细胞计数结果显示，MCAO+tDCS组大鼠SVZ区Nestin+细胞数量与两个Control组相似，但显著低于MCAO+Sham组（P<0.01）。MCAO+tDCS组大鼠梗死的纹状体内Nestin+细胞数量显著增加，与MCAO+Sham组相比有显著差异（P<0.01）。Control+Sham组和Control + tDCS组大鼠SVZ区Nestin+/Ki67+细胞百分比和NSCs数量均无明显差异。 　　2. tDCS处理后缺血损伤侧纹状体中NSCs的分化情况：IFC、WB和TEM检测结果显示，缺血损伤侧纹状体中出现的 NSCs 可以向神经元和少突胶质细胞分化，与MCAO+Sham组相比，MCAO+tDCS组大鼠缺血损伤侧纹状体中由NSCs分化来的未成熟神经元、成熟神经元和少突胶质细胞数量明显增多。Control + Sham 组和Control+tDCS组动物的纹状体中几乎没有观察到NSCs和未成熟的神经元。 　　3. tDCS处理后缺血损伤侧纹状体中Notch1通路激活情况：与Control+Sham组相比，MCAO+Sham组大鼠缺血损伤侧纹状体中配体DLL1、活化状态的Notch1（NICD）和靶基因Hes1的表达显著增高（P<0.01）；与MCAO+Sham组相比，MCAO+tDCS组动物缺血损伤侧纹状体中Jagged1，DLL1，NICD和Hes1表达显著降低，Notch1负性调控因子NUMB表达显著增高（P<0.01），提示tDCS治疗可以显著抑制MCAO大鼠缺血损伤侧纹状体中Notch1信号通路的激活。IFC共定位结果显示，与MCAO+ Sham组相比，MCAO + tDCS组动物缺血损伤侧纹状体中Nestin+/Hes1+双标细胞百分率明显降低（P<0.01），提示 tDCS 主要抑制了缺血损伤侧纹状体中 NSCs 的Notch1通路。Control + Sham组和Control + tDCS组未观察到Nestin+/Hes1+双标细胞。 　　第四部分 tDCS对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用研究 　　材料与方法 　　1. 手术与动物分组：电极植入和MCAO手术按照第二部分实验所述进行，55只符合实验要求的MCAO大鼠随机分两个实验组：MCAO+tDCS组（n=27）和MCAO+Sham组（n=28）；另外54只植入电极的大鼠接受假脑缺血手术，之后随机分为两个对照组：Control+tDCS组（n=27）和Control+Sham组（n=27）。 　　2. tDCS处理：从POD 2开始对tDCS组动物施加tDCS处理，具体步骤按照第二部分实验所述进行。 　　3. 检测方法：采用体重监测、改良神经功能缺损评分（Modified neurological severity score，mNSS）评价tDCS对缺血性脑卒中大鼠一般健康状况和神经功能缺损的改善效果；利用TTC染色检测梗死面积；利用HE染色和Nissl染色检测缺血损伤侧脑组织形态结构；通过酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）含量和脑组织缺血半暗带（Cerebral ischemic penumbra，CIP）中白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-1?（Interleukin-1?，IL-1?）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子-?（Tumor necrosis factor-?，TNF-?）的含量；利用IFC和WB方法检测星形胶质细胞和小胶质细胞的活化情况；通过WB和转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（Terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL）染色检测tDCS处理后CIP的细胞凋亡情况。 　　研究结果 　　1. tDCS处理对缺血性脑损伤大鼠体重和神经功能的影响：与两个Control组相比， MCAO组大鼠体重显著降低（P<0.05），tDCS处理5 d后，MCAO+tDCS组大鼠体重增加明显，与MCAO+Sham组相比具有显著差异（P<0.05），并且该差异的一直持续至POD 14。mNSS结果显示，与两个Control组相比，MCAO手术后，大鼠的mNSS显著升高；tDCS处理5 d后，MCAO+tDCS组大鼠的mNSS较MCAO+Sham组显著降低（P<0.05），在POD 14，MCAO+tDCS组的mNSS仍低于MCAO+Sham组。Control+Sham组和Control+tDCS组大鼠体重和mNSS无明显差异。 　　2. tDCS对缺血性脑卒中大鼠脑损伤程度的影响：TTC染色结果显示，与MCAO+Sham组相比，MCAO+tDCS组大鼠脑梗死面积和脑水肿分数均显著降低（P<0.01）；ELISA实验结果显示，与MCAO+Sham组相比，MCAO+tDCS组大鼠血清NES含量显著降低（P<0.05）。上述检测指标在Control+Sham组和Control+tDCS组中无显著差异。 　　3. tDCS对缺血性脑卒中大鼠损伤侧脑组织形态结构的影响：两个Control组大鼠皮层中神经元和胶质细胞的形态结构及尼氏体的形态和密度均无显著差异。与两个Control组相比，MCAO手术组动物在缺血性脑卒中早期（POD 3）损伤侧大脑皮层形态结构发生明显改变，主要表现为: 皮层神经元数目减少且排列紊乱，伴局部变性及坏死，尼氏体数量明显减少（P<0.01）。与MCAO+Sham组性比，MCAO+tDCS组大鼠损伤侧大脑皮层组织结构比较完整，尼氏体数量明显增加（P< 0.01），提示tDCS可以保护缺血性脑卒中早期脑组织的形态结构。 　　4. tDCS对缺血性脑卒中大鼠损伤侧脑组织中胶质细胞的影响：IFC和WB检测结果显示，在POD 3，MCAO组大鼠CIP中胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）和离子钙接头蛋白抗原（Ionized calcium bindingadaptor molecule-1， IBA-1）阳性细胞数量和蛋白表达水平均显著增加，与两个 Control 相比具有显著差异（P<0.05）；与MCAO+Sham组相比，MCAO+tDCS组大鼠CIP中星形胶质细胞和小胶质细胞数量显著减少、胞体显著缩小，GFAP 和 IBA-1 蛋白表达显著降低（P<0.01）。Control+Sham组和Control+tDCS组大鼠CIP中星形胶质细胞和小胶质细胞的形态与GFAP和IBA-1的蛋白水平均无显著差异。 　　5. tDCS对缺血性脑卒中大鼠损伤侧脑组织中炎症因子水平的影响：ELISA检测结果显示，与两个Control组相比，MCAO组大鼠CIP中促炎因子IL-6、IL-1?、TNF-?的含量和抑炎因子IL-10的含量均显著升高（P<0.01）；与MCAO+Sham组相比， MCAO+tDCS组大鼠CIP中上述促炎因子的含量显著降低（P<0.05），抑炎因子的含量显著升高（P<0.01）。Control+Sham组和Control+tDCS组大鼠CIP中上述检测指标无显著差异。 　　6. tDCS对缺血性脑卒中大鼠损伤侧脑组织细胞凋亡的影响：TUNEL染色和WB检测结果显示，与Control+Sham组相比，在POD 3，MCAO+Sham组大鼠CIP中凋亡细胞百分比显著增加（P<0.05），凋亡相关蛋白Caspase 3表达水平显著增高（P<0.01）；tDCS处理后，MCAO+tDCS组大鼠CIP中凋亡细胞百分比和Caspase 3表达水平较MCAO+Sham组均显著降低（P<0.01）。 　　研究结论 　　1 本实验条件下的tDCS对大鼠重要脏器（脑、心、肺、肝、脾、肾）的形态结构和功能无明显影响，提示电流强度500μA，刺激时长15 min/次的阴极tDCS对大鼠是安全的。 　　2 本实验条件下的tDCS可促进缺血性脑卒中大鼠运动功能障碍的康复。 　　3 本实验条件下的tDCS可通过调节NSCs的增殖、迁移和分化，促进缺血性脑卒中大鼠的神经发生，Notch1通路可能参与了对NSCs分化过程的调控。 　　4 本实验条件下的tDCS可明显减轻缺血性脑卒中早期的脑损伤程度，并改善其神经功能，其机制可能与tDCS抑制神经炎症反应和细胞凋亡有关。 　　5 tDCS 促进缺血性脑卒中大鼠运动功能康复的机制可能与 tDCS 调控神经发生和发挥神经保护作用有关。