检索历史 清除

摘要第一部分 白变蓝克隆形成实验对CRISPR/Cas9 AHI1基因编辑效率的应用与验证<br>　　目的：CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的高低受到多种因素影响，其中不同sgRNA序列对CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的影响尤为重要。目前，评估不同sgRNA编辑效率高低的方法有多种，本课题的目的是检验白变蓝克隆形成实验这种原核评估体系是否也能用于CRISPR/Cas9 系统不同sgRNA编辑效率的评估，并筛选出针对AHI1基因的最优编辑效率的sgRNA，为今后可能的针对该基因的基因治疗提供参考。<br>　　方法：本课题研究的白变蓝克隆形成实验应用经典的蓝白筛选原理，首先，pMD-19T质粒上编码β-gal区域的部分序列被一段含有靶序列的长序列替换，从而形成移码突变，替换后的质粒称为pMD-repeat质粒，单独转化在含有X-gal和IPTG的固体培养基中不能形成蓝色菌落；当与装载有靶序列对应sgRNA的pCas9质粒共转化时，pMD-repeat质粒中靶序列会被sgRNA引导的Cas9蛋白酶切，靶序列前后两段重复序列发生同源重组，使编码β-gal的基因序列由移码恢复为非移码状态，在X-gal和IPTG诱导下，形成蓝色菌落。<br>　　用在线工具设计出AHI1的多条sgRNA，构建含有sgRNA序列的原核细胞基因敲除pCas9质粒和含有对应靶序列的pMD-repeat 质粒，两种质粒等量共转化到DH5α感受态细胞，在含有X-gal-TPTG-氯霉素-氨苄青霉素的培养基培养，观察蓝色菌落占全部菌落比例。构建含有sgRNA序列的真核细胞基因敲除pSpCas9(BB)-2A-GFP 质粒，转染HeLa细胞，发挥基因编辑作用后，提取对照组和 实验组中细胞基因组，在sgRNA上下游区域设计引物，Q5高保真酶PCR，产物纯化，T7E1酶消化，琼脂糖凝胶电泳，观察电泳后条带结果；设计测序引物，纯化后的产物测序，观察Cas9酶切位点附近有无套峰以及套峰的高低。<br>　　结果：CRISPR质粒转染细胞后提取基因组，在编辑位点附近设计引物进行PCR，T7E1酶可以识别产物中错配的碱基并切开双链，电泳条带结果可以反映其sgRNA编辑效率的高低；纯化后的产物测序，测序图中套峰高低也可以反映其sgRNA编辑效率的高低；本课题白变蓝克隆形成实验对AHI1的sgRNA编辑效率的筛选结果与上述两种方法结果一致，筛选出了针对AHI1基因的最优编辑效率的sgRNA。<br>　　结论：白变蓝克隆形成实验可以用于评估CRISPR/Cas9系统不同sgRNA的编辑效率，而且经济、操作简单、省时高效、对设备需求低，为CRISPR/Cas9基因编辑系统sgRNA编辑效率的评价增加了一种新的方法。同时筛选出的AHI1基因最优sgRNA为以后的基因疗法提供参考。<br>　　第二部分 DJ-1基因敲除HeLa细胞株的制备<br>　　目的：利用第一部分的白变蓝克隆形成实验筛选出DJ-1基因最优编辑效率的sgRNA，装载CRISPR质粒，转染人宫颈癌HeLa细胞，制备出DJ-1基因敲除的单克隆HeLa细胞株，以此研究DJ-1基因敲除后对宫颈癌细胞增殖的影响。<br>　　方法：在白变蓝克隆形成实验中，用同样的方法，首先在线工具设计DJ-1的多条特异性高的sgRNA ，构建含有sgRNA序列的pCas9质粒和含有对应靶序列的pMD-repeat 质粒，通过共转化到含有X-gal和IPTG的固体培养基上筛选出最优编辑效率的sgRNA。构建含有其sgRNA序列的基因敲除pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒，转染HeLa细胞，流式细胞仪分选出带荧光单个细胞培养，通过Western blot，免疫荧光，TA克隆测序等方法鉴别出DJ-1基因敲除的单克隆HeLa细胞株，通过CCK-8实验检测DJ-1基因敲除后的细胞株对细胞增殖的影响。<br>　　结果：通过白变蓝克隆形成实验筛选出针对DJ-1基因的最优编辑效率sgRNA，构建的基因敲除质粒转染细胞，分选培养后，通过Western blot，免疫荧光，TA克隆测序鉴定，制备出DJ-1基因敲除的单克隆人HeLa细胞株；与对照组相比，DJ-1敲除后的细胞株细胞增殖减缓。<br>　　结论：通过白变蓝克隆形成实验筛选得到的最优sgRNA，成功的制备出DJ-1基因敲除的单克隆HeLa细胞株，且HeLa细胞增殖受到DJ-1基因表达的影响。验证了白变蓝克隆形成实验在构建单克隆基因敲除细胞株的可行性和有效性，构建的单克隆基因敲除HeLa细胞株为进一步的DJ-1机制研究提供有效工具。