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摘要卤醇脱卤酶又称卤代醇脱卤素酶（HHDHs），催化邻卤醇的碳-卤键裂解进而生成相应的环氧化物。它们也可以在亲核试剂如氰化物，叠氮化物和亚硝酸根离子存在的情况下催化其逆反应，生成β-取代醇。HHDHs已被公认为降解环境污染物有机卤化物的理想工具。同时，他们还可作为生物催化剂用于卤代醇和环氧化物的动力学拆分，并用于制备各种光学纯β-取代醇。<br>　　卤醇脱卤素酶 HheC 的活性中心由四个柔性 loop 区域组成，其中 P175-P188的loop3区域为卤离子结合区域，该区域在酶行使催化功能中起着关键作用。动力学研究表明卤离子的释放为酶促催化邻卤醇脱卤的决速步骤，并且卤离子的释放过程伴随着活性位点构象的变化，说明 P175-P188 碳骨架的柔性对于酶的活性至关重要，但是目前尚未对该区域进行过系统的研究。因此，为了探究卤离子结合区域氨基酸的功能，本论文对该区域以及与loop3有密切关联的F12位的功能进行了系统地研究。<br>　　首先利用丙氨酸扫描技术对 loop3 中各个位点对活性和对映体选择性的影响进行了系统分析。对模式底物1,3-DCP和rac-2-CPE的检测结果显示：（1）H179A， E181A，D182A，P184A在催化活性以及对映体选择性上与野生型相比，没有很大的差异，暗示这几个位点在酶行使催化功能时是非必须的；（2）N176位点的动力学拆分结果显示，N176A位点的对映体选择性发生逆转（由R型偏好，转变为S型偏好），表明该位点可能对 HheC 立体选择性有着重要的调控作用；（3）P175A位点表现出底物的偏好性。其他位点的突变体活性基本完全丧失，表明这些位点在酶行使催化功能的重要性。基于此，后续对上述关键位点P175，N176，Y177， L178，S180，E181，D182，S183，Y185，F186 ，Y187和F12Y进行了深入的研究。<br>　　为了进一步探究loop3中关键位点的功能，对上述氨基酸进行了饱和突变体文库构建及筛选，以及相应的活性及对映体选择性等分析。实验结果表明：（1）N176， Y185、F186、Y187以及F12位点对HheC的对映体选择性具有重要的调控能力。（2）S180、S183和P188位点，所有类型的突变体都不具有任何活性，凝胶过滤结果显示，这三个位点突变为丙氨酸后大部分蛋白处于聚集或解聚状态，因此这三个位点在维持酶的结构中起到非常关键的作用。（3）P175位点以及N176位点，大部分突变体对1,3-DCP都保留有活性，但是对rac-2-CP-E和PNSHH的活性却大部分都丧失，说明这两个位点在不同底物的催化反应上存在着偏好性。（4）177、185、186、187以及F12这些位点只有突变为F和Y，相应的突变体才有活性，替换成其他类型的氨基酸使突变体的活性大幅度地下降。表明了这些氨基酸对维系卤离子结合位点疏水环境的重要作用。同时，突变体177F/185F/186Y/187F的催化活性较野生型HheC有4.5倍的提升。因此Y177、Y185、F186、Y187和F12位的芳香环侧链与周围的氨基酸之间的疏水相互作用力，是酶进行高效催化的重要因素之一。