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摘要软骨组织中氧含量分布不均，且软骨细胞在各结构层中的形态学和生物学差异较大，目前体外实验已证实氧浓度变化会明显影响离体培养软骨细胞的增殖、分化及表型，但生理氧分压对组织中各层原位软骨细胞的影响尚不清楚。研究显示氧分压会影响胞内钙离子浓度，而钙离子水平会影响软骨细胞的胞外基质分泌、软骨的衰老和力学传导等生理功能。所以本研究基于胞内钙信号探究生理氧分压对原位软骨细胞和胞外基质的影响；并从胞内钙信号和生理氧分压出发，找到不同层中利于胞外基质合成的方法。另外，由于现有钙信号检测技术的数据处理过程繁琐且耗时长，所以本研究基于深度学习方法改进了钙信号检测的数据处理过程。本研究启发了在软骨发育的关键科学问题研究中应充分考虑由结构层和氧分压带来的影响，应尽量分结构层探讨软骨细胞和软骨组织的生理或病理状态。同时，本研究有利于指导未来的临床应用，例如为软骨组织修复、原位软骨细胞体外培养、3D打印构建软骨组织等研究，提供钙信号与氧分压方面的理论依据，以及各项胞内钙信号检测指标；通过模拟和调控最适氧分压来影响软骨组织的发育。另外，基于深度学习的钙信号检测技术改进，克服了较厚软骨组织和动态变化细胞轮廓带来的细胞识别困难，以及活细胞中不规则钙信号曲线不易识别的缺点，有利于提高胞内钙信号检测效率，普及钙信号检测技术，降低钙信号检测的使用门槛。所以本研究在丰富理论知识和临床应用方面均有重要的意义。基于以上，本论文的主要研究内容和结果如下：<br>　　① 原位软骨细胞钙信号检测实验和胞外基质检测实验的方法构建<br>　　钙信号检测方法：用荧光钙离子探针标记原位软骨细胞，在普通荧光显微镜下记录并计算出10分钟内细胞的钙响应情况。实验中，利用钙响应波峰形状定义了快慢峰并算出快峰出现率，利用钙响应峰面积算出钙总量。胞外基质检测实验：分别用免疫组化和阿尔新蓝对胞外基质中的COLL-II和GAG进行染色，利用分层圈选胞外基质区域的方法，半定量计算出胞外基质。结果显示，构建的原位软骨细胞钙信号检测法和胞外基质检测法可行。根据已有报道结合钙信号和胞外染色结果，把猪源透明软骨重新分为 6 层，实验结果显示结构层会明显影响原位软骨细胞钙信号和胞外基质代谢。<br>　　② 氧分压对自发钙响应的影响<br>　　软骨组织在不同生理氧分压和钙来源下处理 3 小时和 24 小时后。结果显示，除钙总量在正常氧下升高外，其他钙信号指标均在高氧下增强；钙信号随培养时间的增加而减弱；化学药物模拟低氧环境下的钙信号结果不能代表真正低氧压；发现并总结了各层中益于钙信号增强的最适氧分压。其次，胞外钙和胞内钙对钙信号都有贡献，无论哪种钙源短缺，除快峰外的其他钙信号指标都会明显减弱；当胞外和胞内 Ca2+同时短缺时，所有层原位软骨细胞在缺氧时仍能使用 Ca2+；但高氧和正常氧只能使中间偏下区域的原位软骨细胞使用 Ca2+。另外，研究中还发现在所有氧分压下胞内Ca2+进出细胞质速度快，但胞外Ca2+进出细胞质的速度慢。<br>　　③ 氧分压对软骨组织胞外基质的影响<br>　　软骨组织片在不同氧分压下处理3天和7天后，正常氧利于COLL-II，高氧利于 GAG；在高氧下长时间培养软骨组织会同时减少 COLL-II 和 GAG，但在正常氧下长时间培养软骨组织会增加COLL-II，减少GAG；化学药物模拟低氧环境下COLL-II和GAG的代谢情况不能代表真正低氧压；同时，我们也找到各层中利于COLL-II和GAG的最适氧分压。<br>　　④ 原位软骨细胞钙信号与胞外基质的关系<br>　　所有钙信号指标中，钙总量与COLL-II有关，快峰出现率与GAG有关。由于钙来源与胞内钙信号息息相关，用 EGTA 和毒胡萝卜素(TG)追踪钙来源对胞外基质的影响，可以进一步探讨钙信号与胞外基质的关系。结果显示 COLL-II 的合成需要 Ca2+，并且同时需要胞外和内质网(ER)的 Ca2+，当两种钙源同时缺乏时，胞内会临时启动钙非依赖性途径合成COLL-II；而Ca2+不利于GAG的合成，当胞内钙信号由于钙源的减少而下降时，GAG会明显增多。<br>　　⑤ 基于深度学习的分类问题改进胞内钙信号检测技术<br>　　通过文献调研和分析钙信号检测特征，选用全卷积神经网(FCN)和循环神经网络(RNN)的LSTM-F模型构建新型胞内钙信号检测技术，经过三次模型调整的FCN语义分割法能准确识别出钙响应过程中的原位软骨细胞；把重叠图的细胞还原到原视频，可以准确采集到钙信号时间序列信息，并且不受原图颜色改变的影响；自主搭建符合钙信号曲线特点的LSTM-F网络收敛速度快、准确率高、稳定性好，可准确识别出钙响应波峰个数和钙响应波峰起止点位置。