检索历史 清除

摘要鲎素I（Tachyplesins I，TP-I）是存在于东方鲎血细胞中的由17个氨基酸组成的小分子阳离子抗菌肽，结构内含2个二硫键，其二级结构为2个逆向平行的β-折叠通过1个β-转角结构连接。TP-I具有强烈的抑杀细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞等多种生物活性，被公认为是抗生素潜在替代药物，在医药、畜牧、食品添加剂以及培育农作物新品种等领域均有广阔的应用前景，但由于其获得途径受限制，导致目前并没有规模化TP-I商业产品出现。为解决此类问题，本课题以串联TP-I基因为目的基因，利用基因工程技术构建高效表达TP-I的毕赤酵母（Pastoris pichia）真核表达体系，并且对表达产物进行各方面分析。<br>　　首先，根据文献中已报道的TP-I肽氨基酸序列，分析TP-I多肽结构与其抑杀菌活性的关系、毕赤酵母菌对TP-I多肽的耐受情况等，选择具有17个氨基酸序列的TP-I肽作为目标序列。为实现选择的TP-I抗菌肽在工程菌中的高效表达，设计利用胰肽酶E的特异酶切位点-Ala↓或-Gly↓和羧肽酶A特异性酶切位点（序列C末端氨基酸），连接选定的4肽构成4拷贝串联74肽，根据毕赤酵母菌重组表达偏爱密码子原则，合成重组TP-I肽基因序列，克隆至高效表达载体pGAPZαB上，通过双酶切、PCR以及测序分析，表明成功构建了重组表达载体pGAPZαB-4TP-I。<br>　　然后，将构建的表达载体pGAPZαB-4TP-I通过电转化方法，转化至宿主毕赤酵母菌GS115中，无需诱导，经YPD培养基摇瓶发酵后，利用Tri-SDS-PAGE电泳技术检测发酵液中产物情况，结果表明构建的4TP-I多肽序列能够在宿主菌中表达。将发酵液经Ni亲和层析柱的吸附与洗脱，洗脱液通过超滤离心管的离心浓宿、胰肽酶E和羧肽酶A酶的酶解等操作，再次进行Tri-SDS-PAGE电泳检测分析，显示在3.3 kDa附近存在与化学法合成的TP-I条带一致的蛋白质条带，证明酶切位点设计的正确。<br>　　最后，酶解所得TP-I单体经BCA法和RP-HPLC法测定，1L摇瓶发酵液中TP-I产物含量为27.24~29.53 mg，分别以大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，对TP-I单体产物进行抑菌检测，结果显示TP-I单体具有不同程度的抑杀菌活性；另将TP-I单体产物委托公司做高分辨飞行时间质谱分析，得到分子量为2262.85，与设计的17个氨基酸序列分子量大小一致。<br>　　因此，说明TP-I在毕赤酵母菌GS115表达体系的高效表达具有可行性。