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摘要背景：进行性骨化性纤维发育不良综合症 (FOP) 是一种具有毁灭性的异位软骨内骨化的罕见性疾病，目前尚无有效治疗FOP的手段。FOP是由ACVR1基因突变而引起的一种罕见疾病，突变的ACVR1能够持续激活骨形态发生蛋白Ⅰ型受体，从而诱导病人产生异位骨化。在许多病例中，局部软组织的创伤可导致关节永久性的骨化。对这些骨化部位进行手术切除会引起更严重的骨化，因此，从病人身上获取细胞来进行研究会使病人的病情加重。为了克服这种限制，我们尝试用CRISPR/Cas9和NgAgo两种基因编辑技术将单链寡核苷酸导入进人类诱导性多能干细胞中，从而产生具有杂合点突变ACVR1-FF-iPSCs，从而为FOP疾病的研究提供了新的方法，也为更好的研究FOP的发病机理以及开发出新的治疗药物带来希望。<br>　　NgAgo是一种新兴的基因编辑技术，但目前除韩春雨实验室证明NgAgo能进行基因编辑外，其他实验室还未能证明其是否能进行基因编辑，因此探究其能否进行基因编辑对基因编辑领域的发展具有非常重要的意义。<br>　　研究目的：探究新一代基因编辑技术 NgAgo 能否对人类基因组进行基因编辑；应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对人类诱导多功能干细胞（FF-iPSCs）进行基因编辑，拟构建ACVR1基因G328E位点具有杂合点突变的单克隆细胞株，从而为FOP疾病的研究提供了新的方法，也为更好的研究 FOP 的发病机理以及开发出新的治疗药物带来希望。<br>　　研究方法：设计靶向ACVR1基因外显子区域的gDNA序列，并将gDNA与NgAgo载体共转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），经新霉素（G418）筛选，提取筛选后细胞基因组DNA，将gDNA靶向位点通过PCR扩增出来，对PCR产物进行T7EI检测和测序后，鉴定NgAgo是否对人基因组进行基因编辑；设计靶向ACVR1基因G328E区域的gRNA序列和ssODNs，将gRNA克隆至pSpCas9(BB)-2A-Puro 载体。将克隆获得的gRNA pSpCas9(BB)-2A-Puro载体共转染FF-iPSCs，经嘌呤霉素（puromycin）筛选后挑取单克隆细胞，建立多个单克隆细胞株，提取扩大培养后单克隆细胞株的基因组 DNA，通过PCR 将 gRNA 靶向位点扩增出来进行文库构建，再将构建好的文库通过二代测序技术（Next Generation Sequence）进行检测是否产生具有杂合点突变的单克隆细胞株。<br>　　实验结果：证明 NgAgo 基因编辑技术未能对人类基因组进行基因编辑；成功构建gRNA pSpCas9(BB)-2A-Puro载体；将gRNA pSpCas9(BB)-2A-Puro载体转染到FF-iPSCs后建立 16 个单克隆细胞株，通过二代测序技术测序证实产生了杂合点突变的单克隆细胞株, 但是突变率都非常低，这可能是由于挑取单克隆细胞株时未能成功挑取单个细胞株，从而导致每个细胞株都有正常的 FF-iPSCs 混合在的单克隆细胞株中。因此还需要进一步对获得的杂合点突变细胞株进行筛选和测序验证。<br>　　结论：本研究证明 NgAgo 基因编辑技术未能对人类基因组进行基因编辑；应用CRISPR/Cas9技术，首次成功在FF-iPSCs细胞中对ACVR1基因进行杂合点突变，并且获得具有杂合点突变的单克隆细胞株。研究结果为深入研究 FOP 的发病机理以及新型治疗药物的研发奠定了基础。