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摘要阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经退行性病变，细胞内神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）和细胞外老年斑（senileplaques,SPs）的沉积是其两大基本病理学特征。其中蛋白磷酸酯酶PP2A活性下调导致Tau蛋白过度磷酸化，被认为是形成NFTs的主要原因。核蛋白SET(也常被称为I2PP2A)是PP2A的内源性抑制剂。已有研究结果证明，AD患者脑中SET由胞核转移至胞浆，并在胞浆中滞留，使PP2A活性下调。然而，SET如何滞留于胞浆的具体机制尚不明确。苏木化修饰（SUMOylation）是一种类似泛素化的蛋白质翻译后修饰，因此常被称为小泛素样蛋白修饰。在人类中，SUMO-1,SUMO-2和SUMO-3是主要的SUMO家庭成员，它们通常分类为SUMO-1和SUMO-2/3，因为成熟的SUMO-2和SUMO-3几乎相同。苏木化修饰的功能主要是，影响底物蛋白的生物功能、细胞分布、亚细胞器定位以及蛋白量表达等。越来越多的研究发现苏木化参与到AD的发病过程中。已有研究证明淀粉样前体蛋白APP可以被苏木化修饰。本课题组也已证明，Tau蛋白和β分泌酶（BACE1）也可以被苏木化修饰。那么，是否还存在其他潜在的蛋白可以被苏木化修饰呢？利用苏木化位点预测软件SUMOsp2.0SET进行预测，预测结果发现SET的氨基酸序列上存在与苏木小体结合的序列67LKVE70，提示：SET可能存在与苏木小体结合的可能。<br>　　目的：明确SET是否能被苏木化修饰，探讨SET苏木化修饰对PP2A活性的影响及其参与AD下游事件的分子机制，为AD防治提供有效的药物靶点。<br>　　方法：37℃恒温细胞培养箱，培养人胚肾细胞HEK-293T和稳转人类tau441基因的HEK-293tau细胞。细胞水平共转染SET、SUMO-1与苏木特异性结合酶UBC9，通过免疫共沉淀的方法检测SET与SUMO-1是否结合，通过激光共聚焦检测SET的细胞分布。利用SUMOsp2.0预测SET潜在的苏木化修饰位点，并将此位点的赖氨酸（K）突变为精氨酸(R)，随后将野生型SET-WT或SET突变体分别与SUMO-1、UBC9共同转染HEK-293T或HEK-293tau细胞，通过免疫共沉淀方法检测SET的苏木化修饰水平，通过免疫荧光实验并利用激光共聚焦显微镜观察SET-WT与SET突变体的细胞分布。SET-WT或SET突变体与SUMO-1、UBC9共同转染到HEK-293tau细胞，利用胞核/胞浆蛋白提取试剂盒分离出SET的胞浆蛋白与胞核蛋白，并用免疫印迹实验检测蛋白量的变化。利用丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶检测试剂盒，检测过表达SET-WT或SET突变体与SUMO-1、UBC9后PP2A活性的变化。整体动物水平，3月龄C57/BL6Cnc雄性小鼠，分别在两侧海马的CA1区，脑立体定位注射AAV-Vector,AAV-SET-WT和AAV-SET-K68R等腺相关病毒，通过旷场、条件恐惧、新事物识别以及水迷宫实验来检测小鼠行为学的变化。免疫印迹实验检测小鼠海马synaptotagmin,synaptophysin，synapsin1,NR2A和NR2B等突触相关蛋白以及SET蛋白的变化。大鼠原代海马神经元细胞给予0、0.5、5、50nM Aβ1-42，24小时后，通过免疫印迹实验检测SET的苏木化修饰水平。<br>　　结果：细胞水平共转染SET、SUMO-1与苏木特异性结合酶UBC9，通过免疫荧光和激光共聚焦的方法检测到SET与SUMO-1结合，提示：SET可被苏木化修饰。在转染突变潜在苏木化修饰位点的SET-K68R，其苏木化修饰水平显著降低，提示：K68是SET的重要苏木化修饰位点。酶活测定显示：与野生型SET-WT相比，转染SET-K68R（非苏木化修饰SET）的细胞PP2A活性明显升高，提示：苏木化修饰上调SET对PP2A活性的抑制。免疫荧光结果显示：苏木化修饰促进SET从核向胞浆转运。在C57/BL6Cnc小鼠海马注射AAV-Vector、AAV-SET-WT或AAV-SET-K68R病毒，1个月后，行为学检测结果显示：与对照组相比，SET-WT小鼠出现严重的学习和记忆障碍；与SET-WT组相比，SET-K68R小鼠学习和记忆有显著改善。提示：SET苏木化促进胞浆滞留并引起认知功能障碍。同时发现，感染野生型SET-WT引起突触相关蛋白表达量显著减少，而非苏木化修饰SET-K68R组较SET-WT组有显著改善。也发现：Aβ1-42刺激原代大鼠胚胎海马神经元，可促进SET苏木化修饰水平，并呈浓度依赖性。<br>　　结论：在AD进程中，AD关键分子Aβ促进SET苏木化修饰，引起苏木化修饰的SET滞留于胞浆，进而抑制PP2A活性，导致tau蛋白过度磷酸化、突触相关蛋白受损以及学习记忆功能障碍，加重AD发病。