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摘要目的：自身免疫性肝炎（AIH）的形成和发展是模拟抗原在自身免疫耐受减弱的情况下诱发自身免疫应答，从而导致慢性的肝脏炎症和纤维化。在AIH发病过程中，肝脏自身免疫耐受能力减弱的机制尚不清楚。本文拟研究腺病毒（Ad）和四氯化碳（CCl4）诱发的非AIH炎症，是否能够促进模拟抗原诱发自身免疫应答和AIH，并探讨相关的免疫调节机制。<br>　　方法：（1）尾静脉注射Ad、pCYP2D6、Ad/pCYP2D6、腹腔注射CCl4并用CCl4/pCYP2D6处理C57/BL6小鼠，HE染色检测肝组织中炎症细胞浸润；Real-time PCR检测肝组织中炎症相关基因Il1b、Il6和Tnfa的表达；观察Ad、CCl4及CYP2D6单独作用在第5天、10天和15天时，是否能引起肝脏非AIH炎症；在第28天时，观察Ad/pCYP2D6或CCl4/pCYP2D6实验组中是否有自身抗体产生。在非AIH炎症期间，尾静脉注射psTLR2/4质粒，封闭体内的TLR2/4的配体，Real-time PCR检测肝组织中炎症相关基因Il1b、Il6和Tnfa的表达，观察非AIH炎症是否减弱；同时，观察在模拟抗原存在的情况下，sTLR2/4是否能够降低自身抗体的水平。（2）用不同剂量的Ad和CCl4处理小鼠，检测ALT（谷丙转氨酶）在血清中的酶活水平和TLR2/4配体HSP70和HMGB1的释放情况，同时，Real-time PCR检测第5天时炎症基因Il1b、Il6和Tnfa的表达，观察不同剂量的Ad和CCl4对肝细胞的损伤程度；用不同剂量的Ad、CCl4与模拟抗原共同处理小鼠，ELISA检测自身抗体的水平；注射不同次数的CCl4，用Real-time PCR检测不同时间点炎症基因Il1b和Il6表达变化；用不同次数CCl4和CYP2D6共同处理小鼠，ELISA检测自身抗体变化，观察炎症的强烈程度与免疫应答强度的关系。（3）用Ad、CCl4、pCYP2D6、Ad/pCYP2D6和CCl4/pCYP2D6分别处理小鼠，在第5周时，HE染色检测AIH炎症，并计算第5周、7周和9周的炎症评分，检测ALT在血清中的酶活水平。用天狼猩红染色检测第9周时肝纤维化并计算纤维化评分，同时在第9周和12周时，用Real-time PCR检测肝组织中Col1a1和Col1a2的基因表达；用Ad/pCYP2D6、CCl4/pCYP2D6和psTLR2/4处理小鼠后，在第5周和8周时，HE染色并计算AIH炎症评分，而且在第9周和12周时，用Real-time PCR检测肝组织中Col1a1和Col1a2的基因表达。（4）在Ad/CYP2D6和CCl4/CYP2D6引起AIH时，继续用CYP2D6加强免疫，在第35天和第56天时，ELISA检测自身抗体的变化；用HE染色并计算AIH炎症评分，观察炎症的变化。在第63天时，天狼猩红染色观察肝纤维化的变化并计算纤维化评分。（5）用Ad和CCl4处理小鼠，第14天时，从脾脏和肝脏中分离脾细胞和Treg细胞共孵育3天，流式检测脾细胞的增殖情况；用Real-time PCR检测脾脏和肝脏Treg细胞中Foxp3基因表达；用Western blot检测Foxp3蛋白水平；用Ad、CCl4和psTLR2/4处理小鼠，第14天时，从脾脏和肝脏中分离脾细胞和Treg细胞共孵育3天，流式检测脾细胞的增殖情况；用Real-time PCR检测肝脏Treg细胞中Foxp3基因表达；Western blot检测其蛋白水平，观察非AIH炎症是否破坏肝脏Treg细胞的功能。（6）用Ad和CCl4处理小鼠，ELISA检测血清IL-6及IL-12的蛋白表达；用Western blot检测Treg细胞中p-STAT3和STAT3、p-STAT4和STAT4的蛋白水平。用Ad和CCl4处理小鼠，同时用抗IL-6和抗IL-12的抗体体内封闭IL-6和IL-12，Real-time PCR检测肝脏Treg中Foxp3的mRNA表达；用Western blot检测其蛋白水平。腹腔注射CCl4并pIL-6/pIL-12质粒转染小鼠，用Real-time PCR检测肝脏Treg中Foxp3的表达水平；体外用T细胞增殖实验检测T细胞的增殖比例。<br>　　结果：（1）单独用Ad感染和重复注射CCl4可以引起持续的非AIH炎症，而单独在肝脏转染表达CYP2D6不能引起非AIH炎症。在Ad和CCl4引起非AIH炎症的同时，在肝脏中转染表达CYP2D6，非AIH炎症不影响CYP2D6的表达，但可促进CYP2D6诱发自身免疫应答，产生抗CYP2D6抗体和抗自身肝蛋白抗体。在非AIH炎症期间，用可溶性TLR2/4（sTLR2/4）阻断TLR2/4配体，炎症相关基因的表达下调。抑制非AIH炎症促进CYP2D6诱发自身免疫应答、抗CYP2D6抗体和自身抗体水平显著下降。（2）高剂量的Ad和CCl4导致更严重的肝损伤和更多的TLR2/4配体释放，而且更高浓度的Ad和CCl4使肝组织中的炎症基因的表达更强。在模拟抗原CYP2D6存在时，高浓度的Ad和CCl4诱导更高滴度的抗CYP2D6抗体和自身抗体的产生。与单次注射CCl4相比，重复注射CCl4导致更强的炎症基因表达，而且在模拟抗原CYP2D6存在时，重复注射CCl4可以诱导更强的自身免疫应答。（3）Ad和CCl4导致的肝脏非AIH炎症在5周后消失，且肝损伤也消失；而Ad/CYP2D6和CCl4/CYP2D6处理5周后，却诱发持续的AIH炎症和肝损伤，同时Ad/CYP2D6和CCl4/CYP2D6可以诱发肝纤维化，Col1a1和Col1a2表达上调；非AIH炎症期间用sTLR2/4封闭TLR2/4配体，AIH炎症减弱，不能诱发肝纤维化和Col1a1和Col1a2表达上调。（4）在Ad/CYP2D6和CCl4/CYP2D6诱导产生自身免疫应答后，继续转染表达模拟抗原CYP2D6，增强自身免疫应答，升高自身抗体水平，加重AIH炎症和肝纤维化。如果单独转染且持续表达模拟抗原CYP2D6并不能诱发AIH。（5）在Ad和CCl4诱导的非AIH肝脏炎症中，肝脏的Treg抑制功能下降，但对脾脏Treg的功能无影响，同样，在肝脏Treg中的Foxp3基因表达下降，而脾脏Treg中的Foxp3基因表达无影响，而且肝脏Foxp3基因表达下调，与Ad和CCl4的剂量和CCl4注射次数正相关；在非AIH炎症中，以sTLR2/4阻断TLR2/4配体，可阻止肝脏Treg功能降低，阻止Foxp3基因的表达下调。（6）在Ad和CCl4诱导的非AIH肝脏炎症中，肝组织中的IL-6和IL-12表达持续升高，增强肝脏Treg细胞中的STAT3和STAT4的激活水平。体内单独封闭IL-6或IL-12后，可以部分抑制肝脏Foxp3的表达下调，但如果同时封闭体内的IL-6和IL-12，则可以几乎完全抑制肝脏Foxp3的表达下调。相应地，肝脏转染表达IL-6/IL-12，可以显著抑制肝脏Foxp3的表达，而且可以使Treg的抑制功能下降。<br>　　结论：由腺病毒（Ad）和化学物质（CCl4）诱导的肝脏损伤导致释放更多的危险信号（TLR2/4配体），从而诱导了强而持续的肝脏非AIH炎症。非AIH炎症中持续增加的IL-6和IL-12通过激活肝脏Treg细胞中的STAT3和STAT4通路，抑制了Treg细胞中Foxp3表达，从而降低了Treg细胞的抑制功能。在模拟抗原存在下，Treg细胞功能减弱和IL-12表达上调促进了Th1的免疫应答。同时，非AIH炎症可以促进肝脏内IL-4和IL-25的表达上调，适度表达的IL-4可与IL-25协同作用而启动Th2的免疫应答，但不足以抑制Th1的免疫应答，有利于平衡Th1/Th2应答。因此，Ad/CYP2D6和CCl4/CYP2D6能够诱导小鼠产生AIH，并导致肝纤维化。