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摘要目的：<br>　　1.检测正常妊娠及稽留流产妇女绒毛组织标本中叉头框转录因子3a（forkhead box protein O3a,FoxO3a）与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartic acid protease,Caspase-3）的表达，探讨稽留流产妊娠滋养细胞中FoxO3a表达与细胞过度凋亡的关系，为增进对稽留流产发病机制的认识提供参考资料。<br>　　2.体外细胞实验研究脂联素（adiponectin,APN）对高糖诱导下人滋养细胞系HTR8-SVneo细胞增殖、凋亡相关因子Caspase-3及FoxO3a表达的变化，从分子层面分析脂联素对滋养细胞增殖调控方面可能的保护机制及脂联素与FoxO3a在自然流产中的相互关系，为自然流产机制的深入研究提供实验依据。<br>　　材料与方法：<br>　　1.实验对象<br>　　收集自愿接受负压吸宫术终止妊娠的稽留流产患者及同期正常早期妊娠妇女的绒毛组织标本各30例，体外细胞实验使用人滋养细胞系HTR8-SVneo细胞。<br>　　2.实验分组<br>　　2.1药物筛选的分组<br>　　非高糖环境下体外培养HTR8-SVneo细胞分成：空白对照组及脂联素作用组（依据浓度分为5个亚组：1.0μg/ml组、1.5μg/ml组、2.0μg/ml组、2.5μg/ml组、3.0μg/ml组），在药物刺激后的24h、48h分别检测细胞增殖的情况。<br>　　2.2实验细胞分组<br>　　根据步骤2.1的APN浓度对细胞增殖的影响结果将高糖环境下体外培养的HTR8-SVneo细胞分成4个组，分别为：A组对照组（D-葡萄糖5.5mM）、B组高糖组（D-葡萄糖25.0mM）、C组低浓度脂联素处理组（D-葡萄糖25.0mM+APN1.0μg/ml）、D组高浓度脂联素处理组（D-葡萄糖25.0mM+APN2.5μg/ml）。在药物刺激后的24h、48h收集各组细胞或上清液。<br>　　3.实验方法<br>　　3.1 人绒毛组织标本中FoxO3a和Caspase-3的表达<br>　　免疫组织化学法检测正常早期妊娠孕妇及稽留流产患者绒毛组织标本中FoxO3a和Caspase-3的表达，采用图像分析法对免疫组化切片进行半定量分析。<br>　　3.2 HTR8-SVneo细胞增殖的检测<br>　　在不同时间点运用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定各组细胞的增殖情况。<br>　　3.3 细胞培养上清液中凋亡相关因子Caspase-3含量的检测<br>　　在不同时间点运用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定各组细胞上清液中Caspase-3的含量。<br>　　3.4 FoxO3a mRNA和蛋白的表达<br>　　采用Real-time PCR和western blot方法从mRNA和蛋白水平检测HTR-SVneo细胞FoxO3a/Phospho-FoxO3a表达水平的变化。<br>　　4.统计学分析<br>　　实验数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行t检验、直线相关性分析或单因素方差分析（ANVOA），以P＜0.05认为差异有统计学意义。Real-time PCR数据用比较Ct值法进行相对表达量分析，western blot应用Bio-Rad Quantity One软件对条带灰度值进行相对表达量分析。<br>　　结果：<br>　　1.正常早期妊娠及稽留流产妇女绒毛组织中FoxO3a和Caspase-3表达的情况<br>　　FoxO3a表达在滋养细胞胞质或胞核，Caspase-3表达在滋养细胞胞质；与正常早期妊娠组相比，稽留流产组滋养细胞胞质中的FoxO3a表达显著降低（P＜0.01）和Caspase-3表达显著增加（P＜0.01）；组内FoxO3a及Caspase-3的表达有线性相关（P＜0.05）。<br>　　2.不同浓度脂联素对非高糖环境下HTR8-SVneo细胞增殖的影响<br>　　非高糖环境下不同浓度脂联素与HTR8-SVneo细胞共培养24h或48h，均对细胞增殖的影响无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml脂联素组相对增殖率在90%以上，而2.5μg/ml、3.0μg/ml脂联素组相对增殖率在90%以下。<br>　　3.脂联素对高糖环境下HTR8-SVneo细胞增殖的影响<br>　　高糖环境下HTR8-SVneo细胞添加脂联素共培养后，与对照组相比，24h各组细胞增殖无显著差异（P＞0.05）。48h与对照组相比，高糖组与低浓度脂联素处理组细胞增殖显著下降（P＜0.05）；高浓度脂联素处理组细胞增殖无显著性差异（P＞0.05）。48h的高糖组、低浓度脂联素处理组及高浓度脂联素处理组中两两比较，细胞增殖组间差异显著（P＜0.05）。<br>　　4.脂联素对高糖环境下HTR8-SVneo细胞上清液中凋亡相关因子Caspase-3的影响<br>　　高糖环境下HTR8-SVneo细胞添加脂联素共培养后，与对照组相比，24h各组细胞上清液中Caspase-3的含量无显著性差异（P＞0.05）。48h上清液中Caspase-3的含量从高到低的顺序为：高糖组＞低浓度脂联素处理组＞对照组＞高浓度脂联素处理组，其中高糖组细胞上清液中的Caspase-3含量显著高于低浓度/高浓度脂联素处理组（P＜0.05），对照组、低浓度/高浓度脂联素处理组上清液Caspase-3的含量组间无显著差异（P＞0.05）。<br>　　5.脂联素对高糖环境下HTR8-SVneo细胞FoxO3a mRNA和蛋白表达的影响<br>　　高糖环境下HTR8-SVneo细胞与脂联素共培养48h，细胞内FoxO3a mRNA表达的变化趋势与FoxO3a蛋白表达趋势基本一致。与对照组相比，高糖组和低浓度脂联素处理组可上调FoxO3a的表达，其mRNA的表达有显著差异（P＜0.05），但FoxO3a蛋白表达无显著差异（P＞0.05）；高浓度脂联素处理组FoxO3a mRNA和FoxO3a蛋白的表达均显著降低（P＜0.05）。高糖组的FoxO3a蛋白的表达水平与低浓度脂联素处理组相比较差异不显著（P＞0.05）。高浓度脂联素处理组分别与高糖组和低浓度脂联素处理组相比，FoxO3a mRNA和FoxO3a蛋白的表达水平有显著性差异（P＜0.05）。<br>　　进一步检测其内Phospho-FoxO3a蛋白的表达量，表达的变化趋势与FoxO3a蛋白表达趋势相反，高浓度脂联素处理组Phospho-FoxO3a蛋白表达所占FoxO3a蛋白比例更接近对照组，除高糖组与低浓度脂联素处理组间表达无显著差异（P＞0.05），其余各组组间Phospho-FoxO3a蛋白表达有显著差异（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.稽留流产患者滋养细胞胞浆的FoxO3a表达下降与细胞凋亡相关因子Caspase-3表达增加有相关性。<br>　　2.高糖环境下培养48h可抑制HTR8-SVneo细胞增殖同时增加凋亡相关因子Caspase-3的表达，脂联素可改善高糖环境下滋养细胞的增殖情况，可能通过调节磷酸化FoxO3a蛋白水平对细胞增殖起保护作用。