检索历史 清除

摘要钩吻素子具有重大新药开发价值，但其作用靶点以及作用方式有待研究。转运蛋白(18kDa)[translocator protein(18kDa)，TSPO]，有望成为治疗神经精神疾病等疾病重要的药物作用靶点。本课题组先前和同期研究提示，钩吻素子对TSPO可能存在正性别构调节作用，但有待于论证。近年来，人们日益重视免标记的生物分子间相互作用技术的应用，其中表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术作为一种新型的免标记、实时在线研究生物分子间相互作用的高灵敏传感技术，可实时动态分析药物对膜蛋白的亲和力和相互作用的动力学变化，已应用于别构调节的研究，与放射配体结合分析法可相互印证，并弥补后者需要同位素标记的内源性配体的局限性。鉴此，本文首先采用分子对接分析TSPO与钩吻素子是否存在结合的可能。在此基础上，建立SPR技术，检测钩吻素子与TSPO结合的亲和力，探索钩吻素子能否增强TSPO正位配体与人源TSPO重组蛋白、鼠源TSPO重组蛋白的亲和力，从化学生物学角度进一步论证钩吻素子对TSPO存在别构调节。主要研究内容如下：<br>　　1.分子对接分别计算PK11195、钩吻素子与TSPO的亲和力<br>　　基于分子对接技术，用AutoDock程序计算TSPO与其配体PK11195亲和力大小。分子对接技术结果显示，配体PK11195与TSPO亲和力57.31μM，主要通过范德化力、疏水作用进入蛋白的活性中，活性中心处的PRO18,ALA19,THR20,THR21,GLY22,ALA23,LEU25,LYS26,PRO27,ARG43,TRP44,PHE46,PRO47,TRP50,THR51,THR54,PHE92等氨基酸与PK11195相互作用。钩吻素子与TSPO亲和力为25.34μM,主要通过范德化力、疏水作用进入蛋白的活性中，TSPO活性中心处的GLY22,ALA23,LEU24,LEU25,LYS26,PRO27,ARG43,TRP44,PHE46,PRO47,TRP50,PHE92等氨基酸与钩吻素子相互作用。<br>　　2.钩吻素子对人源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响<br>　　2.1 钩吻素子及TSPO正位配体与人源TSPO重组蛋白的亲和力<br>　　采用SPR技术，通过在CM5芯片上氨基偶联人源TSPO重组蛋白，测得TSPO外源性配体PK11195、外源性配体Ro5-4864、内源性配体PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的KD值分别为199.77±0.12μM、176.93±2.70μM、156.93±5.50μM，进一步检测钩吻素子与人源TSPO重组蛋白结合的KD值为155.33±11.0μM。<br>　　2.2 测定钩吻素子对人源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响<br>　　分别依次测定运行缓冲液中含有10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3M钩吻素子时，浓度为0.1KD值即20.0μM PK11195、17.7μM Ro5-4864、15.7μM原卟啉IX二钠盐流过蛋白固定通道和参比通道时的响应信号。结果显示当钩吻素子浓度分别为10-5、10-7与10-6M时，PK11195、Ro5-4864及PPIX与TSPO相互作用的响应值达到最大值。<br>　　采用多循环动力学检测在10-5M钩吻素子存在的条件下，PK11195与人源TSPO重组蛋白结合的KD值为95.27±0.62μM，对比运行缓冲液不含钩吻素子的PK11195与人源TSPO重组蛋白结合的KD值，钩吻素子能够明显增强PK11195与人源TSPO重组蛋白结合的KD值，有统计学意义（P＜0.001）；10-7M钩吻素子存在的条件下，Ro5-4864与人源TSPO重组蛋白结合的KD值为77.73±0.87μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的Ro5-4864与人源TSPO重组蛋白结合的KD值，钩吻素子能够明显增强Ro5-4864与人源TSPO重组蛋白结合的KD值，有统计学意义（P＜0.001）；10-6M钩吻素子存在的条件下，测得PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的KD值为66.07±3.32μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的KD值，钩吻素子能够明显增强PPIX与人源TSPO重组蛋白结合的KD值，有统计学意义（P＜0.001）。<br>　　3.钩吻素子对鼠源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响<br>　　3.1 钩吻素子及TSPO正位配体与鼠源TSPO重组蛋白的亲和力<br>　　通过原核表达获得鼠源TSPO重组蛋白，经Ni2+亲和色谱柱纯化蛋白并通过Western blot对蛋白进行初步表征。利用SPR技术，通过捕获带有His标签的鼠源TSPO重组蛋白来固定蛋白。测定TSPO外源性配体PK11195、TSPO外源性配体Ro5-4864、TSPO内源性配体PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值分别为161.33±6.1μM、169.75±6.07μM、95.85±4.36μM，进一步检测钩吻素子与鼠源重组TSPO蛋白结合的KD值为97.37±1.76μM。<br>　　3.2 测定钩吻素子对鼠源TSPO重组蛋白与其正位配体亲和力的影响<br>　　分别依次测定运行缓冲液中含有10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3M钩吻素子时，浓度为0.1KD值即16.1μM PK11195、17.0μM Ro5-4864、9.6μM原卟啉IX二钠盐流过鼠源TSPO重组蛋白固定通道和参比通道时响应信号。结果显示当钩吻素子浓度分别为10-7、10-6与10-7M时，PK11195、Ro5-4864及PPIX与鼠源TSPO重组蛋白相互作用的响应值达到最大值。<br>　　采用多循环动力学检测在10-7M钩吻素子存在的条件下，PK11195与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值为95.32±1.80μM，对比运行缓冲液不含钩吻素子的PK11195与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值，钩吻素子能够明显增强PK11195与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值，有统计学意义（P＜0.001）；10-6M钩吻素子存在的条件下，Ro5-4864与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值为67.68±11.09μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的Ro5-4864与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值，钩吻素子能够明显增强Ro5-4864与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值，有统计学意义（P＜0.001）；10-7M钩吻素子存在的条件下，测得PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值为39.87±3.87μM。对比运行缓冲液不含钩吻素子的PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值，钩吻素子能够明显增强PPIX与鼠源TSPO重组蛋白结合的KD值，有统计学意义（P＜0.001）。<br>　　4.钩吻素子对TSPO正位配体与鼠源TSPO脂蛋白体亲和力的影响<br>　　结合相关文献，我们首次利用SPR技术，采用芯片表面重构的方法研究PK11195及钩吻素子与鼠源TSPO脂蛋白体亲和力。测得PK11195与鼠源TSPO重组蛋白的KD值为8.04±1.42nM，进而检测钩吻素子与鼠源TSPO重组蛋白的KD值为0.61±0.11nM。后期工作将用表面重构法继续测定钩吻素子对于TSPO正位配体与TSPO亲和力的影响。<br>　　本文研究结果提示，可用SPR技术检测钩吻素子以及TSPO正位配体与TSPO结合的亲和力，分析钩吻素子对TSPO正位配体与TSPO蛋白亲和力的影响；钩吻素子可显著增强TSPO正位配体PK11195、Ro5-4864或PPIX与TSPO的亲和力，提示钩吻素子对TSPO存在正性别构调节。