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摘要背景：<br>　　食管癌是世界范围内高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，也是我国的第三大肿瘤，由于缺乏有效的早期诊断和治疗方法，预后极差。锌指蛋白750(ZincFingerProtein750，ZNF750)是近期发现含锌指模序的转录因子，文献报道其在鳞状上皮终末分化中起关键作用，且目前与肿瘤相关的功能研究甚少。本人所在课题组前期研究发现在食管鳞癌组织中，ZNF750基因存在显著失活突变及明显拷贝数缺失，食管鳞癌组织中的表达较其癌旁正常组织下调，生物信息学方法预测该基因的失活可能是食管鳞癌发生发展的驱动事件。初步体外功能实验证实了ZNF750对食管鳞癌细胞增殖和转移的抑制作用，但具体作用机制仍不清楚。<br>　　目的：<br>　　本研究旨在阐明ZNF750抑制食管鳞癌生长和转移的作用和机制，明确ZNF750与下游靶基因在食管鳞癌中的相关性及转录调控机制。<br>　　方法：<br>　　1、通过qPCR和westernblot检测不同食管鳞癌细胞系中ZNF750的表达水平，分别在相应的食管鳞癌细胞中过表达和沉默ZNF750基因，通过MTT、Transwell小室、平板克隆形成和血管拟态实验检测敲低和过表达ZNF750基因前后细胞生长、侵袭迀移及血管生成能力的改变；构建稳定过表达ZNF750及稳定敲低ZNF750基因的食管鳞癌细胞株，接种于裸鼠腹部皮下，SPF条件下饲养4-6周后观察并记录肿瘤形成的数量和体积。<br>　　2、将稳定敲低ZNF750前后的食管鳞癌细胞株KYSE140通过PCR-Array检测，对差异表达基因筛选后进行功能和通路的富集分析；将稳定过表达ZNF750前后的食管鳞癌细胞株KYSE150通过RNA-seq检测分析，筛选显著差异表达基因后进行功能和通路的富集分析；<br>　　3、采用westernblot方法检测过表达和沉默ZNF750基因后食管鳞癌细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)相关标志物E-之黏蛋白(E-cadherin，E-CAD)、波形蛋白（Vimentin，VIM)、N-之黏蛋白(N-cadherin，N-CAD)和果幡snail同源蛋白1(snailhomolog1，SNAI1)表达水平变化，分析ZNF750对EMT表型的调节作用；<br>　　4、通过UCSC获取EMT及其他相关基因转录起始位点上游3000bp的启动子区域，查找可能的ZNF750结合位点CCNNAGGC，筛选ZNF750转录调控的下游靶基因，采用qPCR和westernblot方法检测过表达和沉默ZNF750表达后食管鳞癌细胞中靶基因表达量的改变；通过染色质免疫沉淀（chromatinimmunoprecitation，ChIP)和双焚光酶报告基因系统分析ZNF750对下游革巴基因的转录调节活性，探索ZNF750对下游靶基因的调节机制；<br>　　5、通过体外功能实验检测ZNF750下游靶基因SNAI1和DANCR对食管鳞癌细胞表型的影响，通过体内动物实验明确DANCR对裸鼠皮下瘤体形成的作用；针对靶基因进行挽救实验，通过MTT、Transwell小室、平板克隆形成和血管拟态实验观察细胞生物表型的变化；<br>　　6、原位杂交技术明确lncRNADANCR的细胞定位；生物信息学方法预测与DANCR存在相互作用的microRNA，双荧光素酶报告基因实验明确二者之间的调控关系，获得具有显著调控作用的miR-4707-3p;通过qPCR检测miR-4707-3p与DANCR表达的相关性；RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RNABindingProteinImmunoprecipitationAssay，RIP)验证miR-4707-3p与DANCR的互作关系；<br>　　7、使用Targetscan和miRTaBase在线工具预测miR-4707-3p的革巴基因，利用双荧光素酶报告基因实验、westernblot、qPCR明确miR-4707-3p对FOXC2转录活性的调控作用；通过瞬时转染FOXC2特异性的siRNA，观察FOXC2表达降低对食管鳞癌细胞表型的影响；采用westernblot和qPCR方法观察ZNF750敲低及过表达前后食管鳞癌细胞系中ZNF750下游相关基因的表达情况；<br>　　8、对TCGA数据库中食管鳞癌、肺鳞癌、头颈鳞癌和宫颈鳞癌中ZNF750与下游相关基因的表达进行相关性分析。<br>　　结果:<br>　　第一部分：ZNF750通过转录抑制SNAI1抑制ESCC细胞的EMT<br>　　1、ZNF750在食管鳞癌中的失活突变频率显著高于食管腺癌（7%，10/137；0.7%，1/146)，在肺鳞癌中ZNF750的失活突变频率同样高于肺腺癌(7%，10/137；3%，8/230)，提示ZNF750的失活突变可能是食管鳞癌乃至鳞癌发生发展的关键；<br>　　2、KYSE140和KYSE180细胞中ZNF750的敲低可以显著促进食管癌细胞的生长、侵袭迀移及血管生成能力(P<0.05);相反，KYSE150细胞中ZNF750的稳定过表达能够显著抑制食管鳞癌细胞系的增殖、侵袭迀移及血管生成能力(P<0.05);裸鼠成瘤实验亦证实ZNF750对裸鼠皮下瘤体形成及生长的抑制作用(P<0.05)；<br>　　3、稳定敲低ZNF750前后细胞株通过PCR-Array筛选到11个显著差异表达基因（foldchange>2)，主要分布在血管生成和上皮间质转化功能相关的信号通路上，提示ZNF750的作用机制可能与上述2条功能相关的信号通路密切相关;<br>　　4、ZNF750能抑制食管鳞癌细胞间质标志物VIM、SNAIL和N-CAD表达(P<0.05)，促进上皮标志物E-CAD表达(P<0.05)；ZNF750能与SNAI1/2的启动子结合并使SNAI1启动子活性下降40%;干扰SNAI1的表达可以拮抗ZNF750敲低引起的细胞表型，且SNAI1表达下调能促进下游靶基因E-CAD的表达；<br>　　5、在TCGA数据库中，食管鳞癌、肺鳞癌和宫颈鳞癌组织中ZNF750与SNAI1呈显著负相关(r=-0.3484，p=0.0005；r=-0.37,p<0.001；r=-0.156，p=0.0061)，与E-CAD呈显著正相关（r=0.5984，p<0.0001；r=0.46，p<0.0001；r=0.288，p<0.0001)，提示ZNF750在食管鳞癌乃至整个鳞癌中可能通过SNAI1/E-CAD轴对肿瘤的EMT发挥转录调控作用。<br>　　第二部分：ZNF750通过转录抑制DANCR/miR-3707-3p/F0XC2轴抑制ESCC侵袭和转移的机制研究<br>　　1、稳定过表达ZNF750前后的食管鳞癌细胞株通过RNA-seq筛选出与ZNF750表达相关的差异基因652个，且差异基因主要富集在PI3K-Akt、Hippo、点状粘附、细胞骨架蛋白调控等信号通路上，与生物调节、代谢过程、细胞进程等功能相关；生物信息学分析DANCR与ZNF750表达呈负相关，其启动子区存在ZNF750的结合位点，可能受ZNF750的负性调控；<br>　　2、DANCR表达下调能够抑制食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE410的增殖、侵袭迀移和血管生成能力，抑制裸鼠皮下瘤体的生长（P<0.05)；相反，食管鳞癌细胞系ECA109中DANCR表达上调对细胞的增殖、侵袭迀移起促进作用，对裸鼠皮下瘤体生长也起促进作用(P<0.05)，提示DANCR在食管鳞癌中发挥癌基因的作用；在ZNF750敲低细胞中干扰DANCR的表达，能恢复ZNF750对食管鳞癌细胞的抑制作用，提示ZNF750抑癌作用的发挥可能通过抑制DANCR的表达来实现；<br>　　3、DANCR在食管鳞癌细胞中同时定位于胞浆和胞核，生物信息学方法预测得到5个与DANCR互作的靶microRNA，其中miR-4707-3p过表达能够抑制DANCR的表达（P<0.05)，反之，DANCR过表达会引起miR-4707-3p的表达降低（P<0.05)，而DANCR表达降低又会导致miR-4707-3p的表达升高（P<0.05)，提示DANCR与miR-4707-3p可能存在相互抑制的关系；RIP实验提示DANCR存在于miR-4707-3p与Argonaute2(Ago2)蛋白组成的RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)中；<br>　　4、KYSE150细胞系中过表达miR-4707-3p会抑制食管鳞癌细胞的生长、侵袭迀移、血管生成能力（P<0.05)；抑制食管鳞癌细胞系ECA109中miR-4707-3p的表达能够促进细胞的生长、侵袭迀移能力（P<0.05)；FOXC2是生物信息预测得到的miR-4707-3p的靶基因，受miR-4707-3p的负性调控；干扰食管鳞癌细胞系KYSE450中FOXC2的表达能够抑制细胞的增殖、侵袭迀移、克隆形成和血管生成能力(P<0.05)；DANCR可以解除miR-4707-3p对FOXC2的抑制作用；ZNF750在食管鳞癌中可以抑制DANCR/miR-4707-3p/F0XC2通路；<br>　　5、在TCGA数据库中，食管鳞癌、头颈部鳞癌、肺鳞癌和宫颈鳞癌组织中ZNF750与FOXC2呈显著负相关(r=-0.2791，<0.0001；r=-0.1601，尸=0.0002；r=-0.1708，P=0.0026)，提示ZNF750在食管鳞癌乃至鳞癌中可能通过DANCR/miR-4707-3p/F0XC2轴发挥肿瘤抑制基因的作用；<br>　　结论：<br>　　1、ZNF750可能通过SNAI1/E-CAD通路抑制食管鳞癌上皮间质转化；<br>　　2、ZNF750可能通过DANCR/miR-4707-3p/F0XC2这一转录调节机制抑制食管鳞癌的生长和转移。